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Biologie 11e année - Programme détudes : document de mise en
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corail étant donné que « la base des branches est morte » (Figure 1). Le terme de phylogénie sera proposé en 1866 par Haeckel à la place de la généalogie.
SOMMAIRE : CURSUS INGENIEUR 2e ANNEE
UC Bases scientifiques et techniques de l'ingénierie écologique (63 heures) sur le cursus ou domaine des 2A (Forum Vitae semaine Athens
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AVERTISSEMENT
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LIENS Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 THESE Présentée et soutenue publiquement pour l'obtention du titre deDOCTEUR DE L'UNIVERSITE HENRI POINCARE
Mention :
Génomique
parCorentine ALAUZET
Le 06 Novembre 2009
TTAAXXOONNOOMMIIEE DDEESS BBAACCTTEERRIIEESS AANNAAEERROOBBIIEESS ::DDEE LLAA RREECCLLAASSSSIIFFIICCAATTIIOONN
AA LLAA DDEECCOOUUVVEERRTTEE DDEE NNOOUUVVEEAAUUXX PPAATTHHOOGGEENNEESSMEMBRES DU JURY :
R apporteurs : Monsieur le Professeur Benoît JAULHAC Université Louis Pasteur, Strasbourg Monsieur le Professeur Jean-Louis PONS Université de RouenExaminateurs :
Madame le Professeur Estelle JUMAS-BILAK Université Montpellier I Monsieur le Professeur Pierre LEBLOND Nancy Université Monsieur le Professeur Alain LOZNIEWSKI Nancy Université, Directeur de thèse Madame le Docteur Francine MORY Nancy Université, Co-directeur de thèse UUFFRR DDEE MMEEDDEECCIINNEE
E ECCOOLLEE DDOOCCTTOORRAALLEE BBIIOOLLOOGGIIEE SSAANNTTEE EETT EENNVVIIRROONNNNEEMMEENNTTEEAA 44336699 -- RReellaattiioonnss HHôôttee--EEnnvviirroonnnneemmeenntt--MMiiccrroooorrggaanniissmmeess
1Sommaire
Sommaire
LISTE DES TABLEAUX........................................................................ ......................................9 I NTRODUCTION GENERALE ........................................................................ ..................14 DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................ ............17TAXONOMIE MIXTE ET CONSENSUELLE BACTERIENNE.........................................................18
I. Historique de la classification des êtres vivants...........................................................18
II. La phylogénie bactérienne........................................................................
...................221. De l'approche morphologique à l'approche moléculaire.........................................22
2. ARN ribosomiques et horloges moléculaires...........................................................25
a) Généralités sur l'ARNr 16S........................................................................
.........25b) Nouvelle place des bactéries dans l'arbre du vivant............................................26
c) Radiation explosive des phyla........................................................................
......273. Les marqueurs alternatifs à l'ARNr 16S pouvant être utilisés en phylogénie.........32
4. Approches phylogénétiques intégrées......................................................................35
a) Notion de séquences signatures ........................................................................
...35b) Phylogénie de gène / phylogénie d'organisme ....................................................36
5. L'évolution des bactéries est-elle une arborescence : prise en compte des transferts
III. L'unité taxonomique de base : la notion d'espèce bactérienne.................................40
IV. La taxonomie bactérienne ........................................................................
..................441. Intérêt d'une taxonomie bactérienne........................................................................
442. Caractères utilisés pour la classification des bactéries.............................................45
a) Méthodes phénotypiques........................................................................
..............47b) Méthodes génomiques et génétiques ...................................................................52
3. Méthodes phylogénétiques appliquées à la taxonomie ou phylotaxonomie............58
a) Les méthodes........................................................................ ................................58 b) La phylogénomique ........................................................................ .....................674. Approche taxonomique mixte et consensuelle.........................................................69
5. Les classifications actuelles ........................................................................
.............70 a) Le Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.................................................71 b) La List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (LPSN)...............72 c) Les règles de description et de publication des nouveaux organismes................736. La nomenclature bactérienne ........................................................................
...........74LES FIRMICUTES : UN PHYLUM EN PLEIN REMANIEMENT.......................................................76
I . Généralités........................................................................1. Historique et diversité des
2. Classification actuelle des
a) Révisions du phylum Firmicutes........................................................................
.78 b) Exemples de remaniements taxonomiques au sein desClostridia......................79
II. Cas particulier des Clostridium spp.........................................................................
...861. Les
Clostridiaceae : une bien grande famille !........................................................862. Les outils taxonomiques utilisables avec les
Clostridium spp.................................893. Clostridium, structure de paroi et coloration de Gram.............................................90
4. Clostridium et sporulation........................................................................
................915. Clostridium
et résistance aux glycopeptides............................................................92a) Les glycopeptides : mécanismes d'action et de résistance...................................92
b) Sensibilité diminuée à la vancomycine chez certainsClostridium......................97
2Sommaire
6. Clostridium hastiforme ou Tissierella praeacuta ? Une histoire pleine de
rebondissements !........................................................................ .................................987. Clostridium orbiscindens : to be or not to be a Clostridium? ..................................99
LE GENRE PREVOTELLA : UN GROUPE TAXONOMIQUE COHERENT........................................102 I . Données générales........................................................................ ..............................1021. Habitat........................................................................
2. Facteurs de virulence........................................................................
......................1023. Pouvoir pathogène chez l'homme........................................................................
..103II. Classification des Prevotella spp. ........................................................................
.....105III. Identification des bactéries du genre Prevotella......................................................109
1. Caractères morphologiques........................................................................
............1092. Caractères métaboliques........................................................................
.................1093. Caractères génétiques........................................................................
.....................112 a) Données génomiques ........................................................................ .................112b) Données génotypiques........................................................................
...............113IV. Sensibilité aux antibiotiques au sein du genre Prevotella........................................115
1. Résistance aux antibiotiques des
Prevotella
2. Cas particulier du métronidazole........................................................................
....117a) Mécanisme d'action des 5-nitroimidazolés........................................................117
b) Mécanismes de résistance au métronidazole chez les bactéries anaérobies ......118 c) Résistance au métronidazole chezPrevotella
spp. ............................................1213. Gènes
nim et évolution........................................................................ ...................122 ..................................124 MATERIEL ET METHODES........................................................................ ....................126SOUCHES BACTERIENNES ET CONDITIONS DE CULTURE.......................................................127
I. Tissierella spp. et genres apparentés........................................................................
..1271. Souches cliniques et souches de référence.............................................................127
2. Conditions de culture et de conservation ...............................................................129
II. Clostridium orbiscindens et Eubacterium plautii......................................................130
1. Souches cliniques et souches types........................................................................
1302. Conditions de culture et de conservation ...............................................................130
III. Prevotella spp......................................................................... ..................................1311. Souches cliniques........................................................................
...........................1312. Souches types........................................................................
.................................1323. Conditions de culture et de conservation ...............................................................132
IV. Souches utilisées en tant que contrôles....................................................................132
ETUDE DES CARACTERES PHENOTYPIQUES........................................................................
..134 I . Détermination des caractères morphologiques, culturaux et métaboliques ..............1341. Caractères morphologiques, culturaux et biochimiques ........................................134
2. Détermination de la composition en acides gras cellulaires ..................................134
II. Détermination des caractères structuraux................................................................135
1. Composition du peptidoglycane de
Tissierella praeacuta.....................................135 a) Courbes de croissance........................................................................ ................135b) Extraction du peptidoglycane ........................................................................
....136 c) Digestion du peptidoglycane et réduction des muropeptides.............................138 d) Séparation des muropeptides par CLHP en phase inverse.................................138 e) Analyse des muropeptides en spectrométrie de masse.......................................139f) Composition en acides aminés et sucres aminés................................................139
2. Etude de l'ultrastructure de la paroi bactérienne....................................................140
3Sommaire
III. Résistance aux antibiotiques........................................................................
............1411. Détermination de la sensibilité
in vitro aux antibiotiques......................................141 a) Détermination des CMI par la méthode de dilution en milieu gélosé................141b) Détermination des CMI par la méthode du Etest...............................................142
c) Interprétation des CMI........................................................................ ...............1432. Détection des populations hétérogènes par méthodes de diffusion........................143
3. Etude de l'inductibilité et de la stabilité de la résistance aux antibiotiques...........144
a) Méthode en milieu liquide ........................................................................
.........144b) Méthode en milieu solide........................................................................
...........144ETUDE DES CARACTERES GENETIQUES........................................................................
........146 I . Extraction de l'ADN ........................................................................ ...........................146II. Marqueurs phylogénétiques ........................................................................
..............1461. Gène de l'ARNr 16S........................................................................
......................1462. Gènes de ménage........................................................................
............................148III. Gènes de résistance aux antibiotiques.....................................................................149
1. Recherche des gènes de résistance aux glycopeptides...........................................149
a) Recherche des gènes van décrits dans la littérature...........................................149 b) Recherche d'une :Alanine-:X ligase et détermination de son environnement gé nétique ........................................................................2. Recherche des gènes de résistance au métronidazole ............................................151
a) Recherche des gènes nim et des séquences d'insertion associées......................151 b) Localisation des gènes ........153IV. Séquençage des différents gènes ........................................................................
......154 ANALYSES PHYLOGENETIQUES ET ANALYSES MULTILOCUS.................................................155 I. Traitement des séquences ........................................................................
...................155II. Alignement des séquences ........................................................................
.................155III. Construction des arbres phylogénétiques ................................................................156
1. La méthode de Neighbor-Joining........................................................................
...1562. La méthode du maximum de vraisemblance..........................................................157
3. La méthode de parcimonie........................................................................
.............1574. Visualisation des arbres phylogénétiques...............................................................157
IV. Détermination des séquences types........................................................................
..157 V. Détermination des complexes clonaux et clusterisation par arbre de recouvrementVI. Analyses de la diversité génétique, du déséquilibre de liaison et de la recombinaison
.........158ETUDE DES CARACTERES GENOMIQUES........................................................................
.......159 I . Hybridation ADN-ADN........................................................................ .......................159 II. Détermination du G+C%........................................................................ ..................159III. Etude génomique par électrophorèse en champ pulsé.............................................160
1. Préparation et lyse des plugs........................................................................
..........1602. Digestion enzymatique........................................................................
...................1603. Migration électrophorétique........................................................................
...........1614. Etude du squelette
rrn par hybridation...................................................................161 RESULTATS PARTIE I. ANALYSE D'UN GROUPE TAXONOMIQUE EN PLEIN TISSIERELLA PRAEACUTA - CLOSTRIDIUM HASTIFORME : UNE SEULE ET MEME ESPECE ?.......164 I. Résultats préliminaires ........................................................................
.......................1644Sommaire
II. Caractères phénotypiques ........................................................................
.................166III. Caractères structuraux........................................................................
.....................1681. Etude de l'ultrastructure de
Tissierella
2. Analyse de la composition du peptidoglycane par chromatographie liquide haute
performance et spectrométrie de masse (CLHP-SM).................................................171
a) Courbes de croissance........................................................................ ................171b) Extraction du peptidoglycane ........................................................................
....173 c) Analyse des muropeptides par CLHP-SM.........................................................174IV. Organisation chromosomique........................................................................
..........1771. Electrophorèse en champ pulsé........................................................................
......1772. Organisation des opérons
rrn par Southern blot ....................................................181V. Place de Tissierella au sein des différents niveaux taxonomiques............................183
1. Les séquences d'ADNr 16S et des gènes de ménage analysés..............................183
2. Stratégie de sélection des séquences à inclure dans les différents arbres ..............184
3. Comment se situe
T. praeacuta
par rapport aux taxons de haut niveau ?..............1864. Comment se situe
T. praeacuta
au sein des Firmicutes ?......................................1905. Comment se situe
T. praeacuta
au sein desPeptostreptococcaceae ? ..................194
6. Comment se situe
T. praeacuta
au sein de ses plus proches voisins ?...................1987. Gènes de ménage et approche multilocus..............................................................203
a) Souches cliniques et gènes de ménage choisis...................................................203
b) Arbres phylogénétiques ........................................................................
.............204c) Définition des différents profils alléliques (STs)...............................................206
d) Analyse eBurst........................................................................ ...........................207e) Arbre de recouvrement minimal ........................................................................
207f) Réseau phylogénétique........................................................................
...............209g) Analyse génétique des différents loci ................................................................210
VI. Approche mixte et consensuelle : proposition de reclassification de T. praeacuta.214VII. Tissierella spp. et résistance à la vancomycine......................................................217
ETUDE DU MODELE CLOSTRIDIUM ORBISCINDENS - EUBACTERIUM PLAUTII : UNE NOUVELLE E SPECE ?........................................................................ I . Analyse phénotypique ........................................................................ .........................219II. Analyse phylogénétique et génétique........................................................................
.221III. Taxonomie mixte et consensuelle : reclassification.................................................222
RESULTATS PARTIE II. APPLICATION DE L'UTILISATION D'UNE APPROCHE MIXTE ET CONSENSUELLE EN BACTERIOLOGIE CLINIQUE...........................223 RESULTATS PRELIMINAIRES........................................................................ .........................224 I. Identification des isolats cliniques de Prevotella spp.................................................224
II. Sensibilité au métronidazole........................................................................
..............2241. Détermination des CMI et recherche des gènes nim..............................................224
2. Sélection
in vitro de mutants résistants au métronidazole .....................................226III. Deux cas d'échecs thérapeutiques liés à une résistance au métronidazole.............227
1. Bactériémie causée par une souche résistante au métronidazole appartenant à une
nouvelle espèce de ............2272. Echec thérapeutique lié à une souche de
Prevotella buccae résistante au
métronidazole lors d'un épisode de pancréatite aiguë................................................229
APPLICATION DE LA TAXONOMIE MIXTE ET CONSENSUELLE A LA DESCRIPTION D'UNE NOUVE LLE ESPECE IMPLIQUEE EN PATHOLOGIE HUMAINE : PREVOTELLA NANCEIENSIS........231 I. Etude des caractères phénotypiques........................................................................
...2311. Caractères morphologiques et ultrastructure..........................................................231
2. Caractères métaboliques........................................................................
.................2325Sommaire
II. Etude des caractères génomiques........................................................................
......2351. Détermination du G+C%........................................................................
................2352. Détermination de la taille du chromosome et du profil de restriction ribosomique
par électrophorèse en champ pulsé........................................................................
.....235III. Analyse phylogénétique........................................................................
....................236 IV. Approche mixte et consensuelle : description de la nouvelle espèce Prevotella PREVOTELLA SPP. ET RESISTANCE AU METRONIDAZOLE : DESCRIPTION D'UN NOUVEAU GENE NIM INTRINSEQUE A L'ESPECE PREVOTELLA BARONIAE.........................................................240
I. Identification du gène nim de P. baroniae..................................................................240
II. Analyse de l'environnement génétique du gène nimI................................................241
III. Localisation du gène nimI........................................................................
................242IV. Caractère intrinsèque du gène nimI ?......................................................................243
DISCUSSION ........................................................................ CONCLUSION ET PERSPECTIVES........................................................................ .......2606Liste des figures
Liste des figures
Figure 1. La première esquisse d'un arbre évolutionnaire tirée du carnet de notes de Charles Darwin,
First Notebook on Transmutation of Species » (1837). ..................................................... 20
Figure 2. Arbre phylogénétique de Haeckel (1866) représentant les règnes Plantae, Protista et
Animalia
............................................. 23Figure 3. Arbre phylogénétique universel défini par Woese et adapté par Wheelis (361) classant les
êtres vivants en trois domaines :
Archae, Bacteria et Eucarya............................................. 27Figure 4. Représentation schématique des phyla décrits au sein des Bacteria en 1998 et comparaison
avec les données de Woese en 1987 (158)........................................................................
.... 28Figure 5. Arbre phylogénétique basé sur l'alignement de séquences concaténées de 22 gènes
monocopies issus de 280 génomes bactériens....................................................................... 29
Figure 6. Arbre phylogénétique montrant les relations évolutives de 310 espèces bactériennes
appartenant aux phyla majeurs (différenciés par des couleurs). ........................................... 30
Figure 7. Arbre phylogénétique du domaine Bacteria montrant les phyla acceptés (italique) ainsi que
les phyla "candidats" sans représentant cultivé..................................................................... 31
Figure 8. Relations évolutives parmi les êtres vivants se basant sur les caractéristiques structurales des
organismes selon l'approche de R.S. Gupta basée sur l'analyse de signatures protéiques (A) (134) ou selon l'approche de T. Cavalier-Smith basée sur les évolutions majeures en termede structure cellulaire (B) (41).........................................................................
..................... 37Figure 9. L'Anneau de Vie selon Rivera & Lake (282)........................................................................ 37
Figure 10. Visualisation des échanges génétiques en utilisant des réseaux phylogénétiques (splitsgraph
ou réseau réticulé) entre différentes espèces d'abeilles. ....................................................... 39
Figure 11. Représentation en trois dimensions du réseau de vie selon Kunin et coll. (2005) (A) (191)
ou selon Dagan et coll. (2008) (B) (57).........................................................................
....... 39 Figure 12. Comparaison entre l'homologie de séquences d'ADNr 16S (S) et le taux d'hybridation ADN-ADN (D) selon Stackebrandt et coll. (A) (317) ou Keswani et coll. (B) (179)........... 41Figure 13. Pouvoir discriminant de certaines techniques pouvant être utilisées dans une approche
taxonomique mixte et consensuelle. ........................................................................
............. 46Figure 14. Chromatogrammes après analyse en CPG des acides gras volatils et non volatils de
Clostridium difficile (A) et de Clostridium malenominatum (B).......................................... 49
Figure 15. Représentation schématique de l'opéron ribosomique bactérien et du site de restriction de
l'endonucléase I-CeuI......................................................................... .................................. 55 Figure 16. Comparaison des dendrogrammes montrant les relations de sept espèces de Bacteroides spp. (299) ........................................................................ ...................................................... 56Figure 17. Représentation schématique de l'arbre de vie incluant les avancées et les futurs challenges
(cercles rouges) de la phylogénomique (62).........................................................................
68Figure 18. Dendrogramme illustrant les relations phylogénétiques de la famille
Syntrophomonadaceae
et des ordres Halanaerobiales et Thermoanaerobacterales (216)........................................ 81Figure 19. Arbre phylogénétique montrant les relations entre les séquences des trois isolats formant la
nouvelle espèce Moryella indoligenes et celles des bactéries apparentées........................... 82
Figure 20. Dendrogramme illustrant les relations phylogénétiques d'une partie des membres de l'ordre
Clostridiales au sein de la classe Clostridia (216)................................................................ 85
Figure 21. Arbre phylogénétique montrant les relations entre les séquences des Clostridium spp. du
cluster I et de certaines espèces apparentées (50)................................................................. 88
Figure 22. Représentation schématique de la synthèse du peptidoglycane et du mode d'action des
glycopeptides. ........................................................................ ............................................... 937Liste des figures
Figure 23. Arbre phylogénétique basé sur les séquences protéiques de diverses -Ala:-Ala ligases et enzymes apparentées (55)......................................................................... ............................ 96Figure 24. Schéma comparant l'épaisseur de la paroi chez les VSSA (A) et les VISA (B).................. 97
Figure 25. Photographies d'une coloration de Gram des souches Clostridium hastiforme ATCC 33268T (A) et Tissierella praeacuta ATCC 25539T (B)........................................................ 98
Figure 26. Arbre basé sur les séquences d'ADNr 16S montrant les relations phylogénétiques entre
l'espèce P. paludivivens et les autres espèces du genre Prevotella (342)........................... 107Figure 27. Mécanisme d'action et de résistance au métronidazole..................................................... 118
Figure 28 Relations phylogénétiques entre 48 souches de Clostridium basées sur l'analyse des
séquences d'ADNr 16S partielles.........................................................................
.............. 165 Figure 29. Photographie d'une culture de la souche C. hastiforme ATCC 33268T sur milieu BBA avec a pparition de colonies dans la zone d'inhibition du Etest et du disque de vancomycine après96 h d'incubation. ........................................................................
....................................... 166 Figure 30. Images en coupe de la paroi de Clostridium perfringens ATCC 13124T (A) et de P r evotella sp. nov. LBN 293 T (B) (échelle = 50 nm)......................................................................... .. 169 F igure 31. Images en coupe de la paroi de C. hastiforme ATCC 33268T (A et B), de Tissierella sp.LBN 295 (C), et de
T. praeacuta
ATCC 25539
T (D) (échelle = 50 nm). ........................... 169 Figure 32. Graphiques représentant l'évolution de la DO ou de la concentration bactérienne en
fonction du temps pour les souches C. difficile 630, C. hastiforme ATCC 33268T et T issierella sp. LBN 295......................................................................... ............................. 172 Figure 33. Chromatogrammes obtenus après CLPH en phase inverse sur colonne Hypersyl PEP100 pour les souches C. hastiforme 33268T, T. praeacuta 25539T et Tissierella sp. LBN 295. 175 Figure 34. Structure du peptidoglycane d'E. coli (349) similaire à la structure observée pour les
Tissierella
spp. testées......................................................................... ................................ 176Figure 35. Photographies de la migration électrophorétique en champ pulsé après digestion par I-CeuI.
.............. 177Figure 36. Photographies de la migration électrophorétique en champ pulsé après digestion par I-CeuI.
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