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(CTPS)

NBTs et Techniques d'édition du génome :

Impacts potentiels sur l'offre variétale et les activités du CTPS

MélodieGendre

Novembre2016

DEFINITIONS

Allèle:Versiond'ungèneoud'unlocus.

l'organismereceveur. manièresymbiotique. nucléotidique.

Hétérozygotie:Auni veaud'ungène,l'hétérozygotiedécritlaprésencededeuxallèlesdifférentsau

mêmelocus. locus.

Intragène:Séquencegéniqueréarrang éeinvitr odontchacun descomposantsprovient delamême

2 cellule.

Transgène:Séquencegéniqueprovenan td'uneespèce nonsexuellementcom patibleàl'o rganisme

receveur.

LISTEDESABBREVIATIONS

ADN:AcideDésoxyriboNucléique

ARN:AcideRiboNucléique

EMS:Méthanesulfonated'éthylène

HCB:HautConseildesBiotechnologies

POC:ProofOfConceptou"Preuvedeconcept"

TALEN:Transcriptionactivator-likeeffecto rnucleasesou"nuc léaseseffectricesdetypeactiv ateurde transcription" 2

SOMMAIRE

1 MéthodologieetgénéralitéssurlesNBTsettechniquesd'éditiondugénome..............................3

1.1 Méthodologiemiseenoeuvredansl'étude...............................................................................................3

1.2 LesdifférentesN(P)BT........................................................................................................................................4

2 Lestechniquesd'éditiondugénome:SDN/ODM.........................................................................................12

2.1 Mécanismesderéparationdel'ADN.........................................................................................................13

2.2 Moded'actionettypesd'applicationspossiblesenbiologiedesplantes..............................14

2.3 Parallèleavecd'autrestechniquesdecréationvariétale...............................................................17

2.4 UtilisationsdesSDNsenaméliorationdesplantesendehorsdel'éditiondugénomeau

3 Utilisationencréationvariétaleetdanslafilièrevégétale:exemplesetlimites........................23

3.1 Utilisationencréationvariétale..................................................................................................................23

3.2 Modificationd'autresorganismesbiologiquesdelafilièrevégétale.......................................25

3.3 Limitesdansl'utilisationdestechniquesd'éditiondugénome..................................................26

4 Incidencedel'utilisationdestechniquesd'éditiondugénomesurl'innovationvariétale.....28

4.1 Incidencesurlescaractèresdesplanteséditées................................................................................29

4.1.1 Lesespècestravaillées...........................................................................................................................29

4.1.2 Lestraitsmodifiés.....................................................................................................................................30

4.1.3 Structuresgénétiquesdesfuturesvariétés.................................................................................36

4.2 Visiondesprofessionnelsdelasemence................................................................................................38

4.2.1 Lesespoirsetlescraintesdesdifférentsacteurssurl'éditiondugénome.................38

4.2.2 Miseenplacedestechniques..............................................................................................................42

4.2.3 Modificationdesschémasdesélection..........................................................................................43

4.3 Impactsurl'utilisationdesressourcesgénétiques...........................................................................44

4.4 Typesvariétauxetéditionsdugénome...................................................................................................45

4.5 Incidencesurlescollaborationsentreacteursdelafilière...........................................................46

4.5.1 Partenariatsderecherche....................................................................................................................47

2

4.5.2 Ouverturedumarchéàdenouveauxacteurs.............................................................................49

5 Impactsdel'utilisationdestechniquesd'éditiondugénomesurleCTPS.......................................50

5.1 RappeldurôleduCTPS....................................................................................................................................50

5.2 ImpactssurlesévaluationsDHSetVATE...............................................................................................51

5.3 Modificationdesstratégiesd'évaluation................................................................................................52

5.4 Impactsduchangementdesprocessusdesélection........................................................................55

5.5 Changementsdesdémarchesévaluatives..............................................................................................56

5.6 Nondéclarationdeséditionslorsdel'inscription.............................................................................57

1

INTRODUCTIONGENERALE

En2007 ,ungroupedetrava ilmisen placeparlaCommi ssion Européenneaidentifiéun

LusseretDavies2013).

pland'action " Semencesetagriculture durable »|Alim'agri»20 16;"Évaluationduplan • Quelssontlesimpactspotentielsdecesnouvellestechniquesdesélectiondesplantes surl'offrevariétale? • Quelspourraientêtrelesimpactsdecesnouvellestechniquesdesélectiondesplantes surlesactivitésduCTPS? Cetrav ailauseinduCTPSaét éréalis éenparallèle d'uneétu deparleH autCon seildes positionfrançaiseenterme derégle mentationdecesno uvellestechniquesdesélectiondes problématiquesannexes. 2 moded'action destechniquesd'édition dugénome, etlestypesd'applicationsp ossiblesen améliorationdesplantessontprése ntées,puis l'incidencepotentielledel'utilisa tiondec es 3

1 MéthodologieetgénéralitéssurlesNBTsettechniquesd'éditiondugénome

1.1 Méthodologiemiseenoeuvredansl'étude

d'uneanalysede sdonnéesbibliographique setdes basesbrevets,d'unséminaireinterne positionnementdesdiffére ntesinstitutionsfrançaisesetétr angèresainsiqued'unesérie Cetrav ails'estessentielleme ntfocalisésurl estechniquesNBTsditesd'éditiondugénome 1 1 2 1 4

1.2 LesdifférentesN(P)BT

L'ensembledeshuittechniq uesdesélectiondesplante sonten commundepermettre

Ceshuittechniquessontlessuivantes:

• Lacisgénèse/Intragénèse • Legreffagesurporte-greffetransgénique • L'agro-infiltration • Laméthylationdel'ADNassistéeparARN(ou"RdDM»selonl'acronymeanglais"RNA- dependentDNAmethylation») • Lasélectioninverse • Lagénomiquedesynthèse • Lamutagénèsedirigéeparoligonucléotides(ou"ODM»selonl'acronymeanglaisde "OligonucleotideDirectedMutagenesis») • Lesnucléasesdirigées(ou"SDN»selonl'acronymeanglais"SiteDirectedNuclease») àl'A NNEXE2composéedes"Fichesnouvelleste chniques»ti réesdurapportd epremière \ Cisgénèseetintragénèse génomedel'organismereceveur.Les modificat ionsgénétiquesseront alorstransmisesàla descendance. 5 • Cisgénèse espècesontappor tésdemanièrefon ctionnelle,sansréar rangemen tdeséquence,avec • Intragénèse Danslecasde l'intr agénèse,lesgènesoul esséquencesgéniquessontapportéssousforme tronquéeouréarr angéeinvitro .Les séquencesr égulatricesetlesintron snesontpas nécessairementceuxinitialementassociés augène,maisch acundesélémen tsprovientde génomesdeplantesde lamême espèce,oud'espècessexuellemen tcompat ibles(Rommens,

2004).

compatible,ouailleursdanslegénome. \ Greffesurporte-greffetransgénique Legreffonnontransg éniquesedéve loppeainsisurlesystèmeracin aireduportegreffe transgénique,induisantdeséchangesrécip roquesdemolécules(pro téines,pe ptides, composantesdelagreffe.Cette techniqu epeutêt reutiliséeenamélioration desplan tes arboricoles,horticolesetviticoles afind'augmenterlesqualitésagr onomiques dugreffon (Haroldsenetal.,2012;Smolkaetal.,2010). 6 Lespartie saériennesdelaplant eainsicréée,ycomprisles fleurs,f ruitset graines,sont \ Agro-infiltration Latech niqued'agro-infiltrationdestissusnonreproducte urs,parce qu'elleoff reunmoyen classique(Chenetal.,2013). LesAgroba ctériessontlesvecteursdecetteag ro-infiltration;cesont desbactériesq ui possèdentnaturellementlacapacitédetransmet treaugéno medescellulesvégétales une \ Méthylationdel'ADNassistéeparARN(RdDM) Laméth ylationdel'ADNassistéeparARNp ermetlamo dificationépigénét iquedeporti ons dégradésenpetitsARNs interfére ntsméthylés(SiRNAs)qu iparhomol ogiedeséqu ence

2014).

7 Cesmodula tionsépigénétiquespourrontêtret ransmisesàladescendancesurunnombre \ Génétiqueinverse Latech niqueNBTdegénétiqueinvers epermetdereconstru iredes lignéesparen tales (Dirksetal.,2009;Wijnkeretal.,2012). 123
8

Génomiquedesynthèse

égalementdemodif ierdesélément sbiologiquesetdessystèmespréexistantsafindeleur pourraêtretransmisàladescendance. \ Mutagénèsedirigéeparoligonucléotide(ODM) Parhybridationdesséquenceshomologuesentre l'oligonucléotideetlaséquence cible,les

d'uneséquencec iblehomologue,créantun mésappariementau niveaudela/desbasesàmodifi er.Aprèsdétectiondu

9

àladescendance.

\ Nucléasedirigée nucléase. Lacoup uredeladoublehélice d'ADNpa rlaSDN vaactiverlesmécan ismesnaturelsde délétions)aupoin tdecoupureoubi enaf indemodifier précisém entl'ADNparl'insertion spécifiqued'unematriceADN. Al' heureactuelle,quatre famillesdenucléasesdirigées sontouontétéutili séesdansles L'ensembledesmutationscréée sparlesnu cléasesdirigéesdans legénomedelaplante • Méganucléases Lepr emiertypedenucléase découverterepré sentel afamilledesmégan ucléases.Ces méganucléasessontunense mbled'enzymesdetypeend onucléasenécessitantunsite de naturellementprésenteschezdiffére ntsorganismesvivants(bactéries,levures,algues, 10 • Nucléasesàdoigtdezinc(ZFNs) undomainedereconnaiss anceetd eliaisonàl'ADNendoigtsdezinc .Cedoma inede al.,2010). Afindecou perl'ADNcible,l'enz ymeFok1doitêtre dimériséeetdeux ZFNs,sontdonc • TALENs LesTALENs (del'acronymeanglais"TranscriptionActivator-LikeEffector Nuclease»)sont- créélaspécificitédel'enzyme. 2 1 1 1 11 Afindecoupe rl'ADNci ble,l'enzymeFok1do itêtrediméri séeetdeuxTALENs,so ntdonc • CRISPR/Cas9 "ClusteredRegularlyInte rspacedPalindromicRepeats»/"CRISPRAssociatedProtein9») (CharpentieretDoudna,2013). C'estàl'heure actue llelanucléaselaplus utiliséeetétudiéequecesoi tenrecherche précédentes. Cesnucléa sesdetypeCRISPR/Cas9sontdes enzymes naturellesdu systèmeimmunitaire

nucléasesdetypeTALENfor méeschac uned'unbrasde séquencesrépétéesquicréentlaspécificitédel'enzymepourla

12 cible(Figure7)(Jineketal.,2012).

2 Lestechniquesd'éditiondugénome:SDN/ODM

Parmileshuit NBTs,les techniquesdemutagénèsedirigéeparoligon ucléotid e(ODM)etde

Quétier2016).

L'ensembledestechniquesdecréationvariétale paré ditiondugénomereposent surles 13

2.1 Mécanismesderéparationdel'ADN

2015),soi t7*10

-9 mutationspargénérationcel lulairepour laplantemodèleArabidopsis dedétecter,signaleretcorrigerceslésionspourprotégerl'intégritédugénomeetsonb on fonctionnement(Britt,1996). • MécanismedeJonctiondesextrémitésnonhomologues selonl'acronymeAnglais"Non-HomologousEnd-Joining»)es tlemécanismederéparation majoritairesuiteàunec assured oublebrin(ou"DSB»selon l' acronymeAnglais "Double Suiteàladétec tiond elaDSB,les mécanismes deréparationdel'ADNvontêtr eactiv éset aléatoireaupointdecoupure. • MécanismedeRecombinaisonhomologue Leméc anismederéparationdel'ADN parre combinaisonhomologue(ou"HR»sel on del'AD Nauniveaudelas équence cible(Puchtaetal.,1993)ouenag issant surlesgènes 14 Suiteàl'hybrid ation dedeuxséquencesnucléotidiques homologues,lesmécanismesde réparationdel'ADNvonts'enclencheret procéderàlaréparat ion,oulamod ificationdela Ceméca nismedeRHesttrèsconservatif,etprocèdedoncàunerép arationp arfaitedela séquencenucléotidique. • MécanismedeRéparationdesmésappariements activeralesmécanismesd eréparat iondesmésappariementsquiremp lacerales bases

2.2 Moded'actionettypesd'applicationspossiblesenbiologiedesplantes

recherchetravaillantsurle sgénomes,queceso itenbiologieh umaine,an imale,fongique, microbienneouvégétale. 15 \ SDN1 enl'absencedematricederéparation. extrémitésnon-homologues. • Modificationdel'expressiondesgènes L'éditiondugénomedetype SDN1estprinci palementutiliséepourcréerdesmutations • Réarrangementchromosomiqueetcréationdeséquenceschimériques

2015).

-Excisiondegènes:Deuxcoupur esdel'ADNdetypeSDN1peuventêtreprovoquées simultanémentauniveaudeciblesproche s,leu rcoupureconcomitantedelado ublehél ice deuxsitesdecoupure(Zhouetal.,2014). coupure.La portio ngéniquepourraêtreré intégréedemanièreident iqueoudemanière égalementpossiblequ'une séquenced'ADNlibreprés entedanslegénomedelaplantesoit 16

intégréeparcesmé canismes,l esdifférentesex trémitéslibresdesbrinsd'ADN n'étantpas

contrôléesavantlaligation. \ SDN2etODM Leséditio nsdugénomedetypeODMetSDN2résultentdelamodificationdeque lques nucléotidessurl'ADNcibleenprésen ced'unematricederéparationhomologuedifférant référenceparlesmécanism esderépa rationdel 'ADNdetypeRHouRépar ationdes variantallélique. • ODM del'AD N.Parhomolo giedeséqu ence,l'oligonucléotides'hybrideàlaséquencecibl eave c séquencecible.Lesmécanismesdecontrôledel 'intégrit édel'ADNvontdétecter ce mésappariementdeséquencesetainsi activerlesmécanismesderépa rationdel'ADNpar pouvantalorsconduire àlamodificationstab ledelaciblegénomiq uepar laséquenc ede l'oligonucléotide. • SDN2 enprésen ced'unematriceder éparationhomologue.Lamatr icederéparationhomol ogue 17 receveuraugmented'unfacteur10 (Puchtaetal.,1996)laprob abilitéd'induireune efficacespouréditerlegénome quelatechniq ueODM,cec ibienqu'ilse mblequel'action profitdeséditionsSDNs. \ SDN3 derépa rationhomologuepourraêtreutil iséecommeréférenceparlesmé canismesde

2.3 Parallèleavecd'autrestechniquesdecréationvariétale

notrevisionde lagénomiqueetdela product ionden ouvellesvariétésvégétales,d' autres leurexpression.Parmicestechniquesplusanciennes,nouspouvo nsciterlestechniquesde 18 mutagénèseinduit eetdeTilling,ainsiquelest echniquesd'ARNin terférenceet de transformationgénétique. \ RNAi ARNmessag ers(ou"ARNm»)issuesdel'exp ressiond'u ngènedonné,etainsi diminuerla quantitédeprotéinestraduitesetdonc produites.Cetterégulationpost-transcriptionellede rendre"silencieuse".Af indeproduireces petits ARNinterférents,ilestnéc essairede génomedetypeSDN1 enKO,c esdeuxtechno logiesayantpou robject ifd'empêcherla l'effetRNAipeutêtreinsuff isantsileproduitdelatraductiondugènecibleestprésenten etal.,2015;Morgensetal.,2016) \ MutagénèsealéatoireinduiteetstratégieparTilling danslegénom evégétal,avecl'object ifdeproduiredesplantesprésentantunph énotype avantd'êtremisesengerminationpo urainsipermettre dephénotyperet/ougénotyperles 19 stratégieSDN1,lamutagén èsealéat oireinduitecrééeunemut ation"auhasard »,sa ns prédéterminationdelaséquenced'ADNfinale.Cep endant,lastratégieSDN1n'induit aléatoireinduite.Deplus lesSDNspeuventêt remodifi éesafind'ind uirelamodification etal.,2016). Dansunestratég iedeTillin g(TargettingInduced LocalL esionINGenomes)coura mment collectionsdemutantsinduitsa find'ide ntifierdesmutations menantàdesphénotypes intéressantsd'unpointdevuea gronomique.Cesstratégiesdétectentprinc ipalementdes

Editing).

\ Transformationgénétique aléatoired'unconstruitgénétiquedansle génomedelaplantecible.Cet tetransformatio n

intégréaléatoirement danslegénomevégétalpeutêtreuncis gène,unint ragèneouun

transgène. 20 Latechniquedecréa tionvariétalepartransform ationgénétiquepeutêtrecomparée àla sited'insert ionduconstruitgénétique,évitantainsilesinsert ionsaumilieudeséq uences

2.4 UtilisationsdesSDNsenaméliorationdesplantesendehorsdel'éditiondugénome

ausensstrict del'ADNgénomique. \ Modulationdel'expressiondesgènes enacti vantleurtranscription,Tr oistypesdemanip ulationsontpossiblespourmoduler • LaSDNdontl'activiténucléasiqueestinactivéepeutsefixerauniveaudesonsitecible transcriptiondel'ADN. • Lafixa tiondelaSDNdésactivéeaunive aud'unsitedefix ationdefacteur sde génique. 21
• LesSDNsdésactivéespeuventégalementêtre coupléesàdesfacteursspécif iques sousforme protéique,ilestnécessa irequel aséquenc ecodantlanucléasesoitintégrée \ Modificationsépigénétiques

LesSDNsm odifiéesdontl'activiténucléasiqueaété inactivéepeuventêtreutili séespour

enliendirectaveclatechniqueNBTRdDM. Uneenzyme detypeméthylase/déméthylaseouacétylaseestfusion néeaveclaSDNdont

l'activiténucléasiqueestinac tivée.LaSDNconservantsaspéci ficitédeliai sonàl'ADN,la

ciblée(Xuetal.,2016;Doming uezetal.,2015).Cettemodificat iondelastructuredela Lesmodifi cationsépigénétiquesdetypeméthylation/déméthylationetacéty lationsont potentiellementhéritablesettransmisesàla descendan cedesorganismessuruncertain façonstabledanslegénomedelaplante. \ Modificationsdel'ARN LesSDNsd etypeCRISPRp euventê tremodifiéesa findeciblerl'ARNaulieudel'ADN.La

O'Connelletal.,2014;Nellesetal.,2016).

Cettemodificati ondeséquencenucléotidiquesurl'ARN étantp ost-transcriptionnelle,ilest 22
danslegénome. \ Défenseendogènecontrelesvirus LesCRISPR sontinitialementd esenzymesdel 'immunitédesbactériesleurpermettan t \ "GeneDrive» LesSDNsp euventégaleme ntpermettreladiffusi onoul'éradicationdegènesoud'al lèlesà populationetindu iraunecassuredoublebrin auniveau decettecible.Lesmécani smesde "recopiant»la casse tteGene-Drivehomologueàla cibleà sesextrémités.Le génomeai nsi Cettestratégie estprincipalementétudiéep ourl'éradic ationdemoustiquesvecteursde 23

3 Utilisationencréationvariétaleetdanslafilièrevégétale:exemplesetlimites

destechniq uesd'éditiondugénome.Lafréqu encedecespublicatio nss'estgrandem ent intensifiéeavecladéc ouvertede snucléasesdetypeCRISPRqui apermisuneplusgr ande sontproduite sparSDN1;en effet,l esSDN2et3restent délicatesà mettreenoeuv reet demandentencored'importan tsdéveloppementspouraugmenterlesprobabi litésde

3.1 Utilisationencréationvariétale

Ace jour,denomb reusesétudesontdéjàrapportéledév eloppementdecar actères agronomiquesd'intérêtpardésactivationouactivationdegène sàl'aidedeSDNs chezdes desschéma sdesélectionestplusou moins avancée(Noguéetal.,2016):lamajo ritédes voiresontenphasedeproduction. • Destraitsliésàlatoléranceauxherbicidesproduiteparremplacementdesallèlesdu 24

• Descaractèresinnovantsliésàlaqualiténutritionnelleetàl'aptitudeàlatransformation

diminuerl'accumulationde sucresréducteurspendantlestockageaufro iddes etal.,2015).Des tomatesa uxprofilsdematura tionmodifiés ontétéproduitespar • Latoléranceauxmaladiesestégalementunenjeumajeurpourl'éditiondesgénomes. • Uneaugmentationdeproductivitédesculturesparéditiondugénome.Parexempleavec ontdéjàétésoumis(Tableau1):

Tableau1Tableauréférençantle sbrevetssoumisetfaisantréfére nceàl'util isationdesSDNspourd es

applicationsagronomiques. Titre

N°de

Brevet

Technologie

LAPAROICELLULAIRE(AltpeteretJung2015)

WO2015168158

TALENs

(Baraketal.,2016)

WO2016050512

Toutes nucléases

WO2014096972

TALENs

WO2015193858

TALENs

25

WO2016054039

TALENs

CRISPR

(Mathis,Voytas,Zhang,etHaun2014)

WO2014141147

TALENs

Xie2014)

WO2014194190

CRISPR

ANDMETHODSOFUSE(Ciganetal.,2016)

WO2016040030

Toutes nucléases

en SDN3

GENES(Guptaetal.,2013)

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