[PDF] Dosage de lactivité enzymatique Super Oxyde Dismutase (SOD) sur

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LY / MAEP / ECOTOX

Version : 1

Date : 02/02/2016

Page : 0/8

MODE OPERATOIRE

Super

Responsable du

cotoxicologie

Mises à jour

AVERTISSEMENT ET PRECAUTIONS DE SECURITE

LY / MAEP / ECOTOX

Version : 1

Date : 02/02/2016

Page : 1/8

SOM

1 INTRODUCTION

1.1

1.2 Référ

1.3

1.4 Définitions et abréviations

2 VOLET SECURITE

3 PROTOCOLE

3.1 Principe

3.2 Mat

3.2.1 Produits utilisés

3.2.2 Solutions préparées

3.2.3 Matériel

3.3 Mode opératoire

3.3.1 Préparation de la fraction S9 et prédilution

3.3.2 Réglage du spectrophotomètre

3.3.3 Réalisation de la plaque

Préparation de la ga

Réalisation de la plaque

3.4 Expression des résultats

3.4.1

3.4.2 Traitement statistique des résultats

4 SYNTHESE DU DOCUMENT

ANNEXE

Annexe 1e foie de bovin

Annexe 2

Annexe 3

2 1 1.1

Mesure de

Cette mesure peut être réalisée avec des homogénats de foies ou de branchies de xénobiotiques de type métaux lourd, HAP, 2 ) qui est une espèce réactive de 1.2 Le protocole utilisé est adapté de la méthode spectrophotométriqu et al.1et al. 2000)2 1.3 1.4

FCR: Force Centrifuge Relative

Fraction S9

SOD : Super Oxyde Dismutase

1 2

8(6): 491

3 2

NADH et Beta

3 3.1 pr n SOD.

S9. Ce dosage protéique est réalisé selon la méthode de Lowry. Sur organisme entier

poids frais déterminée avant congélation et extraction. La concentration en protéine du S9

pas très 4 3.2 3.2.1

Tableau I

PRODUIT N° CAS RANGEMENT

Potassium chlorure (KCl) 7447-40-7 Armoire 1 (E6)

Disodium Hydrogenophosphate

(Na2HPO4, 12 H20)

10039-32-4 Armoire 1 (E9)

Potassium dihydrogenophosphate,

(KH2PO4)

7778-77-0 Armoire 1 (C7)

Hydrogénocarbonate de sodium

(NaHCO3)

144-55-8 Armoire 1 (C02)

NADH (Beta-Nicotinamide adénine

dinucléotide)

104809-32-7 Congélateur (Sigma N4505)

Manganèse (II) chlorure tétra hydrate

(MnCl2 4 H2O)

13446-34-9 Armoire 1 (C40)

EDTA dihydrate 6381-92-6 Armoire 1 (E18)

Mercaptoéthanol (Beta) 60-24-2 Armoire solvant (Sigma M7154) Super oxyde dismutase (SOD) 9057-89-1 Congélateur (Sigma S8160) 3.2.2

Tampon phosphates (100 mM, pH 7,8)

solution A : 35,8 g de Na2HPO4 -

2PO4 -

Tampon de broyage

5

EDTA dihydrate 0,2 M

7, Manganèse chlorure tétra hydrate 0,1 Molaire

Bicarbonate de sod

Etalons:

Beta NADH 3

Gamme étalon de SOD

mélange EDTA/MnCl2 2. A conserver à 4°C - 2

Beta Mercaptoéthanol

eau pure (utiliser une pipette à déplacement positif). 3.2.3 6 3.3 3.3.1 g dosages non enzymatique tel que le TEAC ou le dosage de protéines. add assortiment de billes de verre de 2 et 1 mm. on

éventue-

masse/volume 1/10 1/50 entre 1/20 et 1/50.

La prédilution

du NADH comprise en 10 % et 70

1/250 pour des S9 de danio juvenile extrait au 1/10

7 3.3.2 ea Villeurbannes

Measurement mode:

3.3.3

Préparation de la gamme étalon

Décongeler un aliquote de solution mère de SOD étalon en b

Tableau II

N°0

CONC. (U/ml)

400

SOD (µl)0

8

Réalisation de la plaque

30 minutes à 340 nm.

3.4

LN (SOD) = a * % inhibition

SOD = a*x2

par mL de prédilution puis en Unité par mL de S9 en multipliant par le facteur de 3.4.2 Les mesures de la variable SOD chez les invertébrés étant souvent effectuées sur des e nombre de réplicats, il compara 9 4

Fabrication de la

d'absorbance 30 min à 340 nm B organismes

Centrifugation ,

SOD préparation de la réactifs : mélange température ambiante 10

ANNEXE

Annexe 1:

gamme étalon est modélisable selon une loi polynomiale du second degré ou par une Activité SOD d'une gamme étalon (0-3,33 U/ml) 0 0

SOD (U/ml)

% d'inhibition Activité SOD d'une gamme étalon (0- 0,66 U/m:) % inhibition vs SOD y = 1E-04x2 + 0,0042x

2 = 0,9988

0,0 0 % d'inhibition

SOD (U/ml)

11

Annexe 2

C

SOD sur gammare

0 0 % de prédilution du S9 1/10 (m/V) % d'inhibition

SOD sur chironome

0 0 % de prédilution du S9 (1/50 m/v) % d'inhibition

SOD sur potamo

0 0 % de prédilution du S9 1/50 (m/V) % d'inhibition 12

Annexe 3Echantillonnage et condit

Poisson: Le foie et les branchies sont prélevés en partie ou en totalité après -. Ils sont disposés en l Danio rerio : Après euthanasie dans un bain de MS222 à 100 mg.L-, bouchon vissant, puis stockées à Gammare : on choisira des individus mâles de taille moyenne dont le poids pas liée à la taille, un échantillonnage homogène est souhaitable et celui proposé le gammare. i

Potamopyrgus antipodarum

échanti

Larves de Chironomus riparius

0 pools sont réalisés,

stocké àquotesdbs_dbs28.pdfusesText_34

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