Mémoire Thème Validation des milieux de culture dans le
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9) : « Les cultures sur milieux solides surtout les cultures géantes
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Restait ensuite à choisir une méthode d'ensemencement et un milieu de culture en vue de l'analyse quantitative de ces bactéries. Dans la littérature les
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MILIEUX DE CULTURE POUR MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE
Les milieux de culture d'UTILISATION GÉNÉRALE sont utilisés dans des applications pour une grande variété d'espèces. Ci-dessous vous trouverez la liste des
TD 1 : Les différents types de milieux de culture.
? Milieu solide : On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide. Le gélifiant le plus utilisé est l'agar-agar ou gélose :
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Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier il doit donc satisfaire aux exigences nutritives
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Un milieu de culture doit satisfaire à toutes les exigences nutritives des micro-organismes : Différents types de milieux 1) Milieux synthétiques ou
les milieux de culture - Microbiologie clinique
milieux de cultures microbiologiques milieu de culture liquide milieu de culture sélective milieu de culture solide milieu de culture enrichis
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Milieux de culture et ensemencements PAR Guido PERSOONE (Gand) INTRODUCTION Au cours d'investigations sur le fouling de substrats immergés en mer
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Les différents Milieux de Culture - Materiel pour Laboratoire - Servilab
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Les micro-organismes exigent pour leur croissance des aliments Ces aliments leur sont fournis au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux de culture
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Ensemencement : o Classique : ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en milieu solide et incuber 24h à 37°C o Rapide : faire une
Quels sont les différents types de milieux de culture ?
Les milieux de culture microbiologique peuvent être préparés sous une forme liquide (bouillon), solide (milieux gélosés) ou semi-solide (échantillonneurs). Les milieux solides et semi-solides contiennent un agent solidifiant comme l'agar ou la gélatine.C'est quoi un milieu de culture en microbiologie ?
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier. Un milieu peut être solide, comme les géloses, ou liquide, comme les bouillons.Quel est le rôle du milieu de culture ?
Les milieux de culture servent de support pour la croissance de micro-organismes (bactéries, levures et moisissures) en leur apportant les éléments essentiels à leur bon développement.- Un milieu sélectif est formulé pour inhiber la croissance de certaines esp?s bactériennes. Ces milieux peuvent être formulés en ajoutant des réactifs sélectifs supplémentaires, tels qu'une concentration saline élevée pour sélectionner les halophiles, éosine-bleu de méthylène toxique pour les bactéries Gram-positives.
Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 1TD 1 : Les différents types de
milieux de culture.Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des microorganismes peuvent se multiplier,
du microorganismeétudié.
On classe les milieux de culture :
1. Selon leur consistance :
) Milieu liquide : par un trouble ou des dépôts et des voiles superficiels. Exemple : bouillon nutritif BN, Bouillon trypticase soja (TSB), Brain-Heart Infusion Broth) Milieu solide : On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide.
Le gélifiant le plus utilisé est -agar
60 °C tout en étant liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion (liqui
Les milieux solides contenant généralement 1.5-2% (15-20 g.L-1 en tubes à essai, culot en tube droit ou couche mince en boites de pétri. la croissance des microorganismes se traduit par la formation des colonies exemple Gélose nutritive GN, Gélose trypticase soja (TSA), gélose Mac Conkey,Gélose Muller-Hinton etc.
) Milieu semi-solide : contenant 0.5-0.75 (5-7,5 g.L-1hugh et Leifson, viande2. Selon leur composition :
) On distingue 2 types de milieux : ) Les milieux complexes ou empiriques : De composition complexe, mal définie, ils peuvent être -d'origine animale : lait, sérum, bouillon et gélose nutritive, gélatine, etc. Tryptycase soja, gélose au Chocolat, gélose au sang, etc.) Les milieux synthétiques ou définis : dans lesquels tous les composants sont connus
uelques-uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen,Urée-Tryptophane.
3. Selon leur utilisation : On distingue en général 4 types principaux de milieux :
A- Milieux de-base ; appelés aussi milieux usuels non sélectifs, on regroupe sous ce vocable tous les
milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en général de préparation assez simple et
généralement peu coûteuse, ces milieux contiennent une base nutritive constituée de molécules azotées
(acides aminés, molécules organiques de de produit vivanteDr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 2(animale, végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits de viande ou de levure exemple gélose et
Bouillon nutritif, gélose et Bouillon Muller-Hinton .B- Milieux d'isolement ; ils peuvent être, suivant les techniques envisagées et les bactéries en cause
soit ;Des milieux non sélectifs enrichis ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des
liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses : du sang, daméliorées par dénaturation thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la
pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais
au milieu de base peut avoir plusieurs buts : apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-
organisme étudié.Des milieux sélectifs, destinés à favoriser la croissance d'une ou plusieurs espèces bactériennes
-organismes. Pour cela on ajoute des éléments quiinhibent la croissance des micro-organismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte
concentration, le thiosulfate de sodium, le cristal violet ou certains antibiotiques, etc.Les éléments
ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-organisme recherché. Ces milieux sont
utilisés pour l'analyse d'un prélèvement polybactérien.Exemples de milieux sélectifs :
milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles (Shigella s'y développe moins vite : environ 48 à 72 heures avant d'obtenir une culture exploitable). Milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes (Candida). gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la pousse desbactéries à Gram positif (action de la vancomycine) et de la plupart des entérobactéries (action de
la Kanamycine). Sur ce milieu, poussent préférentiellement des bactéries anaérobies strictes.
Milieux différentiels
Le milieu de culture dit différentiel ou milieu d'identification indicateur permet de distinguer deux types
de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu met en évidence certaines
caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l'aptitude à dégrader un substrat)
en présence d'indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs colorés de pH ou d'oxydo-réduction
(tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le bleu de méthylène).Exemple Gélose Mac conkey : La gélose Mac Conkey est un milieu sélectif et différentiel au même
temps utilisé pour l'isolement des entérobactéries. En effet, elle contient des agents sélectifs qui
freinent le développement des bactéries à Gram positif: cristal violet et sels biliaires. Il est également
L'orientation de l'identification qui est basée sur l'utilisation du lactose,repérable grâce à 1 indicateur de pH (rouge neutre) les colonies de E coli apparaissent en rouge, car ce
sont des lactoses + tandis que les autres colonies lac apparaissent incolores.La Gélose Chapman (MSA), milieu sélectif des staphylocoques qui différencie la fermentation du
mannitol permettant une orientation entre autres vers Staphylococcus aureus.Le milieu hugh et Leifson est un milieu semi-solide qui permet de déterminer la voie métabolique
empruntée par les différentes espèces bactériennes oxydative ou fermentative, il permet aussi de
déterminer "la voie d'attaque du glucose". Le milieu viande foie -solide, ce milieu est principalement utilisé dans longsDr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 3tubes fins " tube de prévôt » pour la détermination du type respiratoire des micro-organismes, mais aussi
pour la culture de germes anaérobies stricts telles que les Clostridium).Le Mannitol-Mobilité-Nitrate est un milieu semi-solide de culture caractérisé par l'utilisation
de mannitol et de Nitrate et permet la mise en évidence (ou non) de la mobilité bactérienne.
Milieux chromogènes ou discriminants
Ce milieu peut être sélectif ou non. Son principe repose sur la présence d'un ou plusieurs substrats (s)
couplés (s) à une molécule chromogène. Lorsque ce substrat est métabolisé par une enzyme bactérienne
spécifique, le chromogène associé prend une couleur particulière (il devient un chromophore)
directement lisible sur la colonie. Si l'enzyme n'existe que chez une espèce bactérienne donnée,
l'identification est immédiate. Exemple gélose MRSA-ID qui permet de détecter directement les souches
de Staphylococccus aureus résistantes à la méticilline.Principaux ingrédients des milieux de cultures
Constituants Caractéristiques Fonction
Extraits de viandes.
A partir de tissus animaux sélectionnés (à froid : macération; à chaud: infusion, extraits de viandes).Source de protéines peu
dégradées, glucides, sels minéraux, vitamines hydrosoluble. (vitamine B).Peptone
(pancréatine, pepsine, trypsine, papaïne) sur des matières protéiques (viande, caséine, oligopeptides.Hydrolysats
protéines. chlorhydriques sur des ions minéraux.Agar-agar ou gélose
de polysaccharides (agarose 70% et agaropectine 30%). A 90°C se dissout dans température elle forme un gel transparent +/- solide.Solidifier
cultures. les milieux de Produits biologiques Sang, sérum, lait, gélatine, pomme de terre, etc. molécules diverses organiquesBase minérale
Macroéléments ioniques (Na+, K+, Mg2+,
Ca2+, Cl-, PO4-2, SO4-2, HCO3-
Microéléments ioniques ou oligoéléments (Fe, Co, Ti, Zn, Cu, B, Se, Mo, V, W, Mn.)Apportent
électrique,
osmotique, fonctionnement enzymatique.Eau distillée.
a) Exemple 1 : gélose nutritiveConstituant Quantité Fonction
Peptone 5g
Extrait de viande 1g
Extrait de levure 2g
Chlorure de sodium 5g
Agar-agar 15g
pH final à 25°C : pH 6,8± 7Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 4 a) Exemple 2 : Hajna Et KliglerConstituant Quantité Fonction
Peptone 15 g
Extrait de viande 3 g
Extrait de levure 3 g
Peptone pepsique de viande 5 g
Glucose 1 g
Lactose 10 g
Rouge de phénol 25 mg
Chlorure de sodium 5 g
Sulfate ferreux 0,2 g
Thiosulfate de sodium 0,3 g
Agar-agar 15 g
Exercice :
Un microbiologiste veut faire préparer une gélose dite de Müller-Hinton. Cependant, dans son
1) quel est cet ingrédient ?
2) Combien de grammes doit-il ajouter pour la ?
3) Parmi les constituants des milieux de culture, les extraits de levures et les peptones ;
a. Comment peut-on obtenir ces composés ? b. de quoi sont-ils constitués ?Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 5TD N° 02
des bactéries et croissance bactérienneLes microorganismes coexistent en populations mélangées dans les différents environnements
de bactéries différentes108 9 bactéries
par grammes de terre constituée de plusieurs espèces de bactéries et de champignons. Les analyses de
prélèvements pathologiques du milieu hospitalier donnent généralement des cultures polymicrobiennes.
Ceci pose un problème pour les microbiologistes, car on ne peut jamais étudier plusieurs espèces
s autres par des de baseTermes importants :
Ensemencement ou inoculation en microbiologie : introduire un inoculum bactérien dans un milieu de
culture stérile (bouillon ou gélose, ect.) À pipette Pasteur ou anse de platine, ect. Inoculum : Échantillon ou bien quantité de microorganismes mère, destinée à ensemencer (inoculé) au sein favorable à sa multiplication. : Consiste à des ensemencements sur des milieux de culture dans un but de séparation de façon à obtenir des colonies bien distinctes. Repiquage : réensemencement de culture pure dans un milieu de culture neuf.La différence entre " Espèce » et " souche » : Une souche est une partie d'une espèce bactérienne, mais
elle est différente des autres bactéries de la même espèce par une différence mineure, mais identifiable.
1- : lon de culture: Dissociation dans un milieu liquide une colonie bactérienne Ensemencement par stries des milieux gélosésessuie soigneusement le file de platine ou la boucle de la pipette pasteur sur la surface de la gélose cette
méthode se fait dans le cas des géloses coulées dans des boites de pétri ou bien les géloses inclinées en
tubes à essai.Ensemencement par inondation (en nappe) : On inonde la surface du milieu gélosé en boite de pétri par
ré- antibiogramme CASFM).Ensemencement dans la masse
-à--45°), cette méthode est utilisée pour le dénombrement bactérien.Ensemencement par spots
millimètres de diamètres) cette technique permet de faire plusieurs essais de cultures sur la même boite
(ex tester plusieurs souches).Ensemencement par piqure centrale : elle se fait généralement sur des tubes contenant un milieu gélosé
ensemencement du milieu mannitol-mobilité.Ensemencement par écouvillonnage : Tremper un écouvillon stérile dans une solution ou une suspension
bactrienne puis ensemencer la surface de la gélose. (Ex. test antibiogramme CLSI).Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 6 2- cadrans: Cette technique permet de séparer les divers micro-organismes contenus dans le prélèvement initial.Un isolement peut être envisagé pour: séparer des micro-organismes différents au sein d'un mélange,
purifier une souche contaminée ou contrôler sa pureté :1- Tracer sur le fond extérieur de la boite de pétri gélosé deux diamètres perpendiculaires
divisant la boite en quatre secteurs.2- Déposer près bord de la moitié de la boîte correspondante aux cadrans 1 et 2
3- Étaler ce dépôt en réalisant des stries très serrées dans la moitié de la boite (cadrans 1et 2).
4- 5- moitié correspondant aux quadrants 2 et 3. 6- 7- serrées dans la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4. ecteurs ou cadrans : empiétant second. La répétition de cette procédure sur le troisième secteur.Technique de dilution successive :
microbienne importante il en résulte une surface de la boite de pétrie pleine de colonies collées les unes
avec les autres cela empêdes dilutions du produit à analyser. Certaines analyses bactériologiques telles que le dénombrement
bactérien recommandent de faire un dénombrement lorsque la boite de pétrie et chargé avec un nombre
approximatif entre 30 et 300 colonies et donc dans le cas où on a un nombre plus important il est recommandé de faire des dilutions successives :Une solution du produit à analyser est préparée, ensuite des tubes contenant le diluant avec un volume
de 9 ml sont préparés également (dans le cas où on veut faire des dilutions de facteur 10) un volume de
1 ml est transféré à partir du produit a analysé vers un premier tube contenant 9 ml du diluant stérile, il
en résulte une première di-1. Après pour établir une autre dilution, on prend 1 ml àpartir du tube contenant la dilution 10-1 vers un autre tube contenant 9 ml du diluant stérile, la même
procédure ce fait pour obtenir une série de dilution de facteur 10 : 10-1 10-2 10-3 10-4 ect.3- Croissance bactérienne
Définition :
Croissance : augmentation coordonnée des constituants cellulaires, se traduisant par du nombre de cellules.Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 73-1 Division bactérienne :
La bactérie se multiplie par fission binaire : la bactérie grandit puis se divise en deux cellules
se duplique ainsi que les autres constituants. Divers systèmes enzymatiques de synthèse et dedégradation participent à la division cellulaire. Les bactéries sont des organismes asexués dont
la reproduction a lieu par division cellulaire ou reproduction binaire encore appelée scissiparité.La reproduction se fait selon trois phases :
) Allongement de la bactérie, ) Duplication des constituants, ) Séparation3-2 Courbe de croissance
Courbe de croissance : La croissance d'une bactérie s'étudie en milieu liquide. Il existe cinq phases dont l'ensemble constitue la courbe de croissance.Phase de latence : le taux de croissance nul (µ = 0). La durée de cette phase dépend de l'âge
des bactéries et de la composition du milieu. C'est le temps nécessaire à la bactérie pour
synthétiser les enzymes adaptées au nouveau substrat (pas de phase de latence si repiquage sur milieu identique au précédent). Phase de de croissance exponentielle : le taux de croissance atteint un maximum (µ=max). Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est constante. Le temps de doublement des bactéries est le plus court. La masse cellulaire est représentée par des cellules viables (mortalité nulle). Phase de ralentissement : la vitesse de croissance régresse. Il y a un épuisement du milieu de culture et une accumulation des déchets. Il existe un début d'autolyse des bactéries. . Phase maximale stationnaire : le taux de croissance devient nu (µ = 0). Les bactéries qui se multiplient compensent celles qui meurent.Phase de déclin : le taux de croissance est négatif (µ < 0). Toutes les ressources nutritives
sont épuisées. Il y a accumulation de métabolites toxiques. Il se produit une diminution d'organismes viables et une lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiquesendogènes. Cependant, il persiste une croissance par libération de substances libérées lors de
la lyse (croissance cryptique).Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 83-3 Temps de génération
Par définition, le temps de génération ou de doublement (G) est le temps requis pour le
doublement de tous les constituants bactériens. L'augmentation du nombre de cellules durant la phase exponentielle représente une progression géométrique du nombre 2. Une cellule qui se divise en deux est exprimée comme suit: 20 ĺ1. Deux cellules qui se divisent en quatre est exprimé comme allant de 21 ĺ2 et ainsi de suite. Donc la relation mathématique entre lescellules présentes initialement et après un temps donné en phase exponentielle est: N= N0
2n, Où N représente le nombre théorique final de cellules, N0 le nombre initial et n le nombre de
générationsEffet de la température
Les bactéries peuvent être classées selon leur température optimale de croissance.- Bactéries mésophiles (Ex. : Escherichia coli) : température de croissance proche de celle du
corps humain (37°C) - Bactéries thermophiles (Ex. : Thermus aquaticus) : températures de croissance comprises entre 45°C et 70°C. - Bactéries hyperthermophiles (Ex. : Archaea) : températures de croissance supérieures à80°C .
- Bactéries psychrophiles (Ex. :) : Températures proches de 0°C (optimum à 10-15°C). - Bactéries psychrotrophes (Ex. : Pseudomonas) : températures de croissance proches de 0°C avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles.Exercice 01 :
On veut faire le dénombrement bactérien dans un aliment solide. Pour cela, on a préparé une
dilution initiale à partir de cet aliment. dans cette dilution initiale ? expliquez.2) Après ensemencement et incubation, on a obtenu une culture très dense (trop chargée). Quelle
est la méthode à faire à la dilution initiale pour avoir une culture moins dense dans un deuxième
ensemencement ?1: phase de latence,
2: phase de croissance exponentielle,
3 : phase de ralentissement,
4 : phase stationnaire,
5 : phase de déclin.
Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 93) Quel est le nombre de bactéries recommandé pour faire le dénombrement ?
Exercice 02 :
Selon la température optimale de la croissance (figure ci-dessous),Dr. Khadir Abdelmounaim,
TD Microbiologie, L2, Département de Biologie, Université Oran1, Ahmed Ben Bella 10TD N° 3 : Identification bactérienne
1. macroscopique : Définition
solide.Cette description doit mentionner :
La taille : diamètre des colonies. Vous pouvez mesurer cette taille à l'aide d'une règle graduée. On distingue :¾ Colonies punctiformes : Colonies à peine visibles, dont la taille est inférieure au millimètre
¾ petites colonies : Colonies dont le diamètre est compris entre 1 et 2 mm ¾ Colonies moyennes : Colonies dont le diamètre est compris entre 3 et 5 mm ¾ Grosses colonies : Colonies dont le diamètre est supérieur à 5 mmLa vue de profil (élévation) avec
vue de dessus (bords ou contours) (bords : dentèles, en étoile, ovoïde, régulière, ondulée, lobée).
L'aspect de la surface (lisse, rugueuse, brillante). L'opacité. Les colonies opaques ne laissent pas passer la lumière contrairement aux translucides. Certaines sont très transparentes, car ils laissent passer la lumière.La consistance. Elle se juge au moment du prélèvement. On distingue les colonies crémeuses des
sèches et des muqueuses (gluantes). La couleur ou pigmentation. La plupart des colonies isolées sur gélose ordinaire sont couleur crème (sans pigment) mais certaines sont blanc porcelaine, jaune, vert,...; Figure 1 : aspect macroscopique des colonies bactériennesTaille et
Punctiform
Filamenteu
Irrégulière
Fusiform
Elévation
Plane Elevé
Convex
Bombé
Bossue
BordRégulie
Ondul LobDentel
Filamenteu
Bords surélevésRhizoïd Circulaire
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