[PDF] OPTIMISATON DE LA CROISSANCE DE CELLULES HEK293

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**'$$3' 078
1 9 ;00) ;0 1% ifi ifi

UNIVERSITÉifiDEifiMONTRÉALifi

ifi ifi ifi OPTIMISATON DEifiLAifiCROISSANCEifiDEifiCELLULESifiHEK293ifiEXPRIMANTifi

CUVÉE-ALIMENTÉEifi

ifi ifi

CÉDRICifiVALLÉEifi

ifi ifi ifi

MÉMOIREifiPRÉSENTÉifi

(GÉNIEifiCHIMIQUE)ifi

AOÛTifi2013ifi

ifi ifi ifi ifi ifi

UNIVERSITÉifiDEifiMONTRÉALifi

ifi ifi ifi ifi ifi

Ceifimémoireifiintitulé:ifi

ifi OPTIMISATION DE LA CROISSANCEifiDEifiCELLULESifiHEK293ifiEXPRIMANTifi

CUVÉE-ALIMENTÉEifi

ifi enifi :ifiMaîtriseifièsifisciencesifiappliquéesifi aifiétéifi :ifi iiiifi ifi

DÉDICACEifi

»ifi

WoodyifiAllen,ifiManhattanifi

ivifi ifi

REMERCIEMENTSifi

Je tiens à remercier Olivier pour son soutienifietifisesifiprécieuxificonseilsifiauificoursifideifimonifi

avais le plus besoin. Merci aussi à Zahra qui zen et à relaxer en manipulant des cellules et beaucoup de bonheur avec ta nouvelle famille.ifi

pointilleusesifi cellulesifi HEK,ifi saifi contributionifi fûtifi essentielleifi àifi ceifi mémoire.ifi Àifi Constance,ifi Kim,ifi

une part de mes connaissances.ifi

July pour les momentsifiintrépidesifiauifilaboratoireifiainsiifiqueifisesificonseilsifiavisésifisurifilaifivieifideificoupleifi

Merci à Claudia, Nesrine, XinheifiZhao,ifiXiaojieifiRen etifiaux autres membres du groupe pour leur

encore beaucoup de projets avec toi. ifi ifi vifi ifi

RÉSUMÉifi

développement des bioprocédésifis

essais cliniques dans le domaine. De plus, les coûts de production doivent être suffisamment bas

pourifi permettreifi unifi coûtifi raisonnableifi deifi vente.ifi Laifi majoritéifi desifi moléculesifi biologiquesifi sontifi

unifi métabolismeifi lent,ifi deifi faiblesifi densitésifi cellulairesifiatteintesifienifi cultureifietificonduisentifi àifidesifi

concentrationsifienifians les meilleurs cas. Les

traductionnellesifitrèsifisimilairesifiàificellesifiprésente Laificultureifienifimodeificuvéeifiestifi

Laificuvée-alimentéeifi estifi leifimodeifi deifi cultureifi dominantifi

nonifi limitantesifi deifi nutrimentsifidansifi leifi milieuifi deifi culture,ificeifi quiifiaifi généralementifi pourifi effetifi

dPar contre, cela entraîne principalifidesificulturesifi enifi modeificuvée-alimentée.ifiParifi leifi biai a

productionifi deifi cesifi métabolitesifi néfastesifipeutifitoutefoisifiêtreifi réduiteifi enifi manipulantifi lesifi voiesifi

intérféron-Įȕ le cadre de principalifiétaitifideifi

cuvée-alimentée.ifiDesificulturesifienififlaconsifienifimodeifibatchifiontifipermis de mettre en

pyruvateificarboxylaseifi(293-F5).ifies taux de consommationifiduifiglucoseifietifideifilaifi ,ifi laificombinaisonifilaifiplusifiapteifiàifimaximiserifilaificroissanceifi viifi ifi

cellulaireifi parmiifi lesifi conditionsifi testées.ifi Enifiappliquantifiuneifi stratégieifi deifi contrôleifi prédictififi enifi

cells/ml enifiplusifideifiprolongerifileifimaintienifideifilaifiviabilitéificellulaire.ifiPourifilesificellulesifi293-D9,ifilaifi

phaseifi deificroissanceifiexponentielleifi demeuréeifi s cultures réalisées avec la lignée parentale,ifi laifi

les cellulesifiexprimantifilaifiPYC.ifiLaifiviabilitéifideifilaificultureifiaifiétéifimaintenueifi2,5ifijoursifideifiplus,ificeifiquiifi

une augmentation modesteifiifi(7M)ifi Enfin, le mainti glucoseifienifiimplantantifiuneifi

production. Pour les cellules 293-F5,ifilaifi stratégieifi appliquéeifi àifi conduitifi àifi uneificoncentrationifi

cellulaireifimaximaleifideifi10,7ifix106 cellules/mlifietifilaifiquantitéificumulativeifideifibiomasseifi(intégraleifideifi

facteur 4 parifirapportifiauifimodeifibatchifipourifileifimêmeificloneifi(61ifimg/L)ifiainsiifiqueifipourifilaifilignéeifi

parentaleifi(57ifimg/L).ifi effet néfasteifisurifilaifiproduction,ifiprobablementifion du lactate qui a atteint une PYC sur le métabolisme se limite surtout au niveau des réactions cytosoliques.ifi ifi viiifi ifi

ABSTRACTifi

The market for biologics is growing fast. Toifimeetifithisifiincreasingifidemand,ifibioprocessifi

reduceifi lactateifi andifi ammoniaifi production,ifimetabolicifi engineeringifi canifi beifi used.ifi Inifi thisifi thesis,ifi

HEK293ifi cellsifi stablyifi producingifi interferon-ɲȕ s yeast

pyruvateifi carboxylaseifiwereifiused.ifiifiTheifiaimifiwasifitoifi maximizeificellifigrowthifi byifiusingifi fed-batchifi

technology.ifiifi

Effecientfeedifi(Invitrogenifi Lifeifi Technology)ifisolutionifi supplementedifi withifi glutamineifi ledifi toifi theifi

shakeififlasksifiincreasedifitheifimaximumificellifidensityifiupifitoifi10x106 cells/mlifiandifiextendedificultureifi

7M.ifiSignificantifi increasesifi inifi cellifi growthifi andifi productionificoncentrationifiwereifiachievedifiwhenifi

glucoseifi wasifi maintainedifi atifi aifi set-pointifi byifi anifi automaticifi controlifi loopifi forifitheifimetabolically-

viiiifi ifi

likelyificausedifibyifi theifi highifi lactateifi concentrationsifiobservedifi inifi thisifi case,ificreatingifiunfavorableifi

ixifi ifi

TABLE DES MATIÈRESifi

TABLE DES MATIÈRESifi............................................................................................................ifiIX

LISTE DES TABLEAUXifi............................................................................................................XII

LISTE DES FIGURESifi...............................................................................................................ifiXIII

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONSifi.............................................................................ifiXIV

LISTE DES ANNEXESifi............................................................................................................ifiXVII

CHAPITRE 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUEifi..........................................................................ifi4

1.1 Les cellules mammifèresifi..................................................................................................ifi4

1.1.1 Les conditions de culturesifi............................................................................................ifi5

1.1.2 Les milieux de cultureifi..................................................................................................ifi6

1.1.3 Le métabolisme des cellules animalesifi.........................................................................ifi7

1.1.4 Le lactate comme nutrimentifi.......................................................................................ifi10

1.2 ....................................................................ifi10

1.2.1 La variation des conditions de cultureifi........................................................................ifi11

1.2.2 ion du milieu de cultureifi...........................................................................ifi14

1.2.3 Substitution des sources de carboneifi...........................................................................ifi15

1.3 Le génie métabolique dans le métabolisme primaireifi.....................................................ifi16

1.3.2 .............................ifi21

1.3.3 Le retrait sélectif des déchets métabolique en cours de cultureifi.................................ifi21

xifi ifi

1.4 Les stratégies de cultureifienifimodeififed-batchifi..................................................................ifi22

1.4.1 Le contrôle des nutriments à bas niveauifi....................................................................ifi22

1.4.2 ......................................................................ifi24

1.5 Le suivi et le contrôle des cultures en mode fed-batchifi..................................................ifi25

1.5.1 Les paramètres en ligneifi..............................................................................................ifi26

1.5.2 Le contrôle des cultures par des méthodes de suivi indirectifi......................................ifi30

1.5.3 Le contrôle des cultures par mesure directeifi...............................................................ifi32

1.5.4 a priori .....................................................................ifi33

1.5.5 Le contrôle aidé par des modèlesifi...............................................................................ifi34

2.1 Protocoleifi.........................................................................................................................ifi37

2.2 Ajout de nutriments non limitantsifi..................................................................................ifi38

2.3 .................................................................................ifi39

2.4 Ajout simultané de glucose et glutamineifi.......................................................................ifi41

2.5 ................................................................ifi42

CHAPITRE 3 EXPLOITING THE METABOLISMifi OFifi PYCifi ifi ifi ifiEXPRESSING HEK293

CELLSifiINifiFED-BATCHifiCULTURES ...........................................................................................ifi44

3.1 ..................................................................................................ifi44

3.2 Auteursifi...........................................................................................................................ifi44

3.3 Abstractifi..........................................................................................................................ifi45

3.4 Introductionifi....................................................................................................................ifi45

3.5 Materials and Methodsifi...................................................................................................ifi48

3.5.1 Cell linesifi.....................................................................................................................ifi48

3.5.2 Culture medium and feeding solutionifi........................................................................ifi48

3.5.3 Batch and fed-batchificellificultivationifiinifishakeififlasksifi..................................................ifi48

xiifi ifi

3.5.4 Bioreactor cell cultivationifi..........................................................................................ifi49

3.5.5 Feeding strategy for bioreactorifi..................................................................................ifi49

3.5.6 Analytical techniquesifi.................................................................................................ifi50

3.5.7 Oxygen uptake rateifi.....................................................................................................ifi51

3.6 Resultsifi............................................................................................................................ifi52

3.6.1 Batch experiments in shake flasksifi.............................................................................ifi52

3.6.2 Fed-batchifiexperimentsifiinifishakeififlaskifi........................................................................ifi53

3.6.3 Batch experiments in bioreactorsifi...............................................................................ifi54

3.6.4 Fed-batchifiexperimentsifiinifibioreactorsifi........................................................................ifi56

3.6.5 Oxygen uptakeifirateifi.....................................................................................................ifi58

3.7 Discussionifi......................................................................................................................ifi59

3.8 Conclusionsifi....................................................................................................................ifi62

DISCUSSION GÉNÉRALEifi.........................................................................................................ifi67

CONCLUSION ET RECOMMANDATIONSifi.............................................................................ifi71

ifi xiiifi ifi

LISTE DES TABLEAUXifi

Tableau 1.1 -ifiComparaisonifidesifieffetsifid'uneificultureifihypothermiqueifiselonifidifférentesifiétudes.......ifi13

Tableau 1.2 -ifiComparaisonifidesifieffetsifideifilaifipyruvateificarboxylaseifi................................................ifi20

Tableau 2.1 -ifiComparaisonifientreifilesifidifférentesifisolutionsifi d'alimentationificontenantifi uneifiseuleifi

Table 3.1 -ifiImpactifiofifirecombinantifiPYC2ifiexpressionifionifimetabolicifiratesifiinifishakeififlasksifi.............ifi54

Table 3.2 -ifiImpactifiofifirecombinantifiPYC2ifiexpressionifionifimetabolicifiratesifiinifibioreactorsifi...............ifi56

xiiiifi ifi

LISTE DES FIGURESifi

Figure 1.1 -ifiMétabolismeifiénergétiqueifisimplifiéifi..............................................................................ifi8

Figure 1.2 -ifiSchémaifiréactionnelifiproposéifiparifi(Irani,ifiWirthifietifial.ifi1999)ifipourifiexpliquerifil'effetifideifi

Figure 1.3 -ifiex situ ........................................................ifi28

Figure 2.1 -ifiProfilifideificroissanceifienififonctionifidesifidifférentsificocktailsifideifinutrimentsifiajoutésifi........ifi38

Figure 2.2-ifiProfilifi deifi croissanceifi enifi fonctionifi desifi différentesifi alimentationsifi enifi maintenantifi leifi

Figure 2.3 -ifi .............ifi43

Figure 3.1 -ifiDesignifiofifitheifiautomatedififeedingifistrategyifi..................................................................ifi51

Figure 3.2 -ifiViableificellifi(A),ifiglucoseifi(B),ifiglutamineifi(C)ifiandifilactateifi(D)ificoncentrationsifiprofilesifi

Figure 3.3 -ifiViableificellifi(A),ifiglucoseifi(B),ifiglutamineifi(C),ifilactateifi(D),ifiammoniaifi(E)ifiandifiinterferonifi

Figure 3.4 -ifiComparisonifiofifimaximumifiinterferonifititerifibetweenifi293-D9ifiandifi293-F5ificellsifiduringifi

Figure 3.5 -ifiComparisonifiofifispecificifioxygenificonsumptionifirateifibetweenifi293-D9ifiandifi293-F5ificellsifi

xivifi ifi

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONSifi

µ Taux de croissance

293-D9 Lignée parentale de HEK293 utilisée dans ce projet

293-F5 Lignée de HEK293 exprimant la pyruvate carboxylase utilisée dans ce projet

Ac-CoA Acétylcoenzyme A

ADN acide désoxyribonucléique

ARN acide ribonucléique

ATP Adénosine triphosphate

BHK Baby hamster kidney

CHO Chinese hamster ovary

Cit Citrate

DMFe+ 1,1'-dimethylferricinium

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

EPO Érythropoïétine

FADH2 Flavine adénine dinucléotide

FDA Food and Drug Administration

FIA Flow injection analysis

Glc Glucose

Gln Glutamine

xvifi ifi

GSifiGlutamineifisynthétaseifi

ifiifiGURifiGlucose uptake rate ifiifiifiHEKifiHuman embryonic kidney ifiifiHPLCifiHigh performance liquid chromatography ifiIFNifiInterféronifi ifiifiifiIVCifiIntegral of viable cells ifiIVCCifiIntegral of viable cells concentration ifiLacifiLactateifi ifiifiMalifiMalateifi ifiifiifiifiMFAifiMetabolic flux analysis ifiOAAifiAcideifioxaloacétiqueifi ifi xviifi ifi

PyrifiPyruvateifi

SEAPifiSecreted Alkaline Phosphatase

ifisiRNAifismall interfering RNA ifiifiSucifiSuccinateifi ifiYSIifi2700ifiYellow Spring Instrument ifiifiĮifiAlpha-ketoglutarateifi ifiifiifi xviiifi ifi

LISTE DES ANNEXESifi

ANNEXEifi1ifi Profilifideificroissanceifienififonctionifidesifidifférentesifialimentationsifienifimaintenantifileifi

ifi ifi ifi 1ifi ifi

INTRODUCTIONifi

Le vieillissementifi desifi populationsifi dansifi leifi mondeifi occidentalifietifilaifi croissanceifi deifi laifi

consommationifi deifi médicamentsifi dansifi lesifi paysifi enifi voieifi deifi développementifi augmententifi

considérablementifi laifi demandeifi mondialeifi pourifi lesifi produitsifi pharmaceutiquesifi etifi

biopharmaceutiques.ifiLeifimarchéifidesifiproduitsifibiopharmaceutiquesifi lesifiplusifienifi

croissanceifi(Dietmair,ifi Nielsenifi etifi al.ifi 2011).ifi ifi Lesifi coûtsifi associésifi auifi développementifi etifi àifi laifi

fardeauifi financierifi queifi représententificesifi dépensesifi pourifi leifi systèmeifi deifi santéifi etifi lesifi compagniesifi

s.ifi Laifi principaleifi problématiqueifi liéeifi auifi modeifi fed- métaboliques dans les milieux de culture,ifidéchetsifiroissanceifi cellulaireifietifilaifiproduction.ifi consiste à manipuler le phénotype des cellules produc ifi avantageuse pour la production de protéines recombinantes. Leur origine humaine permet 2ifi ifi

carboxylase cytosolique (PYC) (HenryifiandifiDurocherifi2011).ifiIlifienifiestifirésultéifiuneifilignéeificellulaireifi

présentantifi unifi métabolismeifi hautementifi efficace,ifi c'est-à-direifiproduisantifi trèsifi peuifi deifi déchetsifi

été exploité pour une culture en mode fed-batch,ifiniifi dansifidesificonditionsifi semblablesifiàificellesifi

Objectifsifi

ifi

en mode cuvée-alimentéeifipourifi uneifi cultureifi deifi cellulesifi HEK293ifi surexprimantifi laifi pyruvateifi

Caractériser les lignées HEK293 parentale et modifiée en mode cuvée dans des maximise la croissance cellulaire à petite échelle.ifi uerificetteifistratégieifideifi façonifiautomatisée.ifi Valider la stratégie développée en la transposant dans un environnement contrôlé,

Organisationifiduifimémoireifi

cultureifi cellulaireifi enifi modesificuvéeifi etifi cuvée-alimentée,ifi afinifi deifi soulignerifi lesifi grandesifi

3ifi ifi Leifi chapitreifi suivantifiprésenteifiunifi articleifiscientifiqueifi

pourifioptimiserifilaificroissanceificellulaireifienifieffectuantifileifichange Enfin,ifileifidernierifi

4ifi ifi

CHAPITRE 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUEifi

1.1 Lesificellulesifimammifèresifi

Le secteur desifiprotéinesifirecombinantesifiestifienifipleineifiexpansionifietifireprésenteifiuneifipartifi

relativementifi complexesifietifinécessitentifiunifidegréifideifiglycosylationifi élevéifipourifiêtreifiactives.ifiLesifi

hautsifi rendementsifi deifiproductionifidusifi àifi uneifi croissanceifi rapideifi etifi àifi uneifi densitéifi finaleifi élevéeifi

neifisontifigénéralementifipasifienifi mesureifideifi produireifi desifi protéinesifi correctementifi repliéesifi etifi

Lesifi cellulesifi animalesifi sontifi complexesifi etifinécessitentifidesifi milieuxifi deificultureifitrèsifi completsifietifi

Plusieursifi lignéesifimammifèresifiontifi étéifi adaptéesifi pourifi laifi productionifi deifi protéinesifi

recombinantesifi, chacune possède des caractéristiquesifidifférentesifietifiavantageusesifi

produireifi deifihautesificoncentrationsifideifi produit,ifi deifi qualitéifi uniformeifietifienifi unifi tempsifi restreintifi

demeureifileifi plusifi souventifi lesificritèresifidominantsifi(Birchifi andifi Racherifi 2006)

peuvent aussi influencer,ifitelsifiqueifilaifiqualitéifietifileifitypeifideifitransformationsifipost-traductionnellesifidesifi

surifilesifi coûtsifi deifi productionifietifi deifi purification.ifiLesifi plateformesifi cellulairesifi proviennentifidesifi

al.ifi 2010),ifilesifiChinese Hamster Ovary (CHO),ifi

caractérisées et qu'ilifiexisteifidéjàifiplusieursifiprotéinesifirecombinantesifiproduitesifiparifileifibiaisifideificetteifi

5ifi ifi possiblement moins actives.ifiLesificellulesifihumainesifiHuman Embryo Kidney (HEK)ifi sontifiquantifiàifiellesifitrèsifiutiliséesifi ouifi

2011).ifi Ellesifi sontifi facilementifi transfectablesifi etifi présententifi laifi plupartifi duifi tempsifi uneifi bonneifi

productivitéifispécifique.ifiLme deifiprotéineifi

trèsifi procheifi deifi celleifiretrouvéeifi (Durocherifi andifi Butlerifi 2009).ifiCetteifi similaritéifi

1.1.1 Les conditions de culturesifi

Une lignée cellulaireificontinueifiestifiétablieifiàifipartirifideificellulesifiorganisme hôte,ificesifi

cellulesifisontifi dansifidesifimilieuxifideificultureificontenantifiduifisérum.ifiPériodiquement,ifi

uneifi partieifi desifi cellulesifiestifitransféréeifi dansifi duifi milieuifi fraisifiafinifideifi maintenirifi desifi conditionsifi

Parifi laifi suite,ifiellesifisontificapablesifideifi seifirépliquerifi sansifi arrêtifietifileurifi duréeifi deifi vieifi estifi ainsiifi

deificu industrielleifioùifilaificuveifiagitéeifidemeureifileifimodeifideificultureifi

tropifiaugmenter,ifitypiquementifi elleifidoitifi êtreifi stableifiautourifi deifi260-320ifimOsm/L.ifiUneifiquantitéifi

oxygène doit aussi être disponibleifiauxificellulesifipourifipermettreifilaifi respiration,ifigénéralementifi

6ifi ifi

lieuifiefficacement,ifiagitation duifivolumeifideificultureifiestifinécessaire.ifiOr,ifilesificellulesifimammifèresifienifi

1.1.2 Les milieux de cultureifi

Les milieuxifideificultureifiactuelsifipourifilesificellulesifianimalesifisontifitrèsificomplexesifietifitententifi

pouvantifivarierifideifi f . seifi tourneifi

maintenantifiversifilesifimilieuxifichimiquementifidéfinisifietifiéviteifileifisérum,ifilorsqueifipossible (Li,ifi

mêmeificoncentration,ificeifi quiifi réduitifi considérablementifi laifi variationifi entreifi lesifi différentsifi lots.ifiLaifi

mêmesifibénéficesifiqueifi leifi sérumifi(Pacis,ifi

compositionifipeutifiégalementifivarierifisensiblementifi. Ilsifipeuventifiêtreifiuneifisourceifi

7ifi ifi variabilité du milieuifietificeifiproblèmeifiresteifidoncifientierifidansificertainsificas.ifi

Quelquesifiajoutsifisontifiaussiifi

réduire les agrégats de cellules, le niveau de calcium dans le milieu est réduit et desifiagentsifianti-

cisaillementifiagitation et/ou le bullage.ifi

1.1.3 Le métabolismeifidesificellulesifianimalesifi

Le métabolisme desificellulesifianimalesificomprendifidesifimilliersifideifiréactionsifi(Seth,ifiHosslerifietifi

de la cellule,ificelle-ciifiestifistockéeifiadénosine triphosphate (ATP).ifiLaififormationifideifi

probableifi

1994).ifi

parifimoléculeifi deifiglucose,ifisuivantifiuneifi chaîneifi deifi 10ifiréactions.ifiEnsuite,ifi leifi pyruvateifipeutifi êtreifi

mitochondrie,ifioùifiilifiperdifiunificarboneifisousififormeifideifiCO2, devient acetyl-CoAifiparifilaifipyruvateifi

parifilaifidégradationifiduifipyruvateifi(NADHifietifiFADH2 dansifilaifi lesifimilieuxifideificultureifi(entreifi2-5ifimM).ifiifi2 ouifi 8ifi ifi énergétiqueifidesifi cellulesifi(Petchifi andifi Butlerifi 1994).ifioxydéeifi

ammoniumifi(NH4+) ouificifi(NH3)ifiestifi laificonversionifideifilaifiglutamineifienifi glutamateifi etifi

(Ozturkifi andifi Palssonifi 1990).ifiCommeifimentionnéifiprécédemment,ifileifi métabolismeifi desifi lignéesifi

cellulairesifiimmortaliséesifiestifi passablementifidérégléifi seifi etifial.ifi1999).ifiifi ifi

1.1.3.1

depuisifilongtempsifidémontréifiqueifilesificellulesifisontifiincapablesifioxyder la totalité duifiglucoseifienifi

9ifi ifi

CO2 etifienifieauifiparifilaifivoieifioxydative.ifiEnififait,ifidansifileificasifidesificellulesifihybridomes,ifi 96ifiMifiduifi

demeureifipasifimoinsifiqueifidansifitoufaible parifirapportifiàifi laifiglycolyse.ifiOr,ifi :ifileifilactate.ifiPourifi

pallierifi laifi glutamineifi joueifi unifi rôleifi prépondérantifi dansifi leifi métabolismeifi

(Reitzer, Wice et al. 1979;

Lanksifi 1986).ifiCependant,ifi laifi glutaminolyseifi produitifi uneifi grandeifi quantitéifiammoniacifitelifi

cellulairesifitransformée.ifi Enifi effet,ifi9Mifideifi laifi glutamineifi estifitransforméeifienifi lactateifidansifi desifi

1.1.3.2 Les métabolites secondairesifi

Le lactate produit en grande quantité par le métabolisme déficientifi desifi cellulesifi

entreifi1ifietifi5mMifi(Schneider,ifiMarisonifietifi al.ifi1996;ifiYangifiandifiButlerifi2000).ifiDeuxifimécanismesifi

perturbeifilesifi gradientsifi électrochimiquesifideifi laifi celluleifi ammoniacifi

réactions enzymatiquesifi(Schneider,ifiMarisonifietifial.ifi1996;ifiCruz,ifiFreitasifietifial.ifi2000).ifiParificontre,ifilesifi

10ifi ifi la qualité des protéinesifirecombinantesifienifialtérantifileifipatronifideifi

YangifiandifiButlerifi2000).ifi

sifiélevéesifienifi produit.ifiC'estifipourquoiifi prochainesifisections.ifi

1.1.4 Le lactate comme nutrimentifi

Enificoursifi deifi culture,ifi souventifi lorsqueifi leifi glucoseifi estifi totalementifi consommé,ifi laifi

Dietmairifi etifi al.ifi 2013).ifi Cetteifi consommationifi enifi finifi deifi cultureifi neifi permetifi cependantifi pasifi deifi

maintenirifi laifi phaseifi exponentielleifi deifi croissance.ifi Parifi contre,ifi lesifi cellulesifi quiifi présententifi unifi telifi

acides aminés sont encore à des niveauxifinonifilimitants.ifiLuoifi(Luo,ifiVijayasankaranifietifial.ifi2012)ifiaifi

consommation de lactate plus tô du problème des déchets métaboliques. ifi

1.2 Lculturesifienifimodeifibatchifi

Le mode cuvéeifi(batch)ifiestifitrèsifiutiliséifipourifidesififinsifideifirechercheifietifidéveloppementifiafinifi

cellulaireifidansifi ceifi cas-ciifi peutifi êtreifilimitéeifi sifi ammoniac 11ifi ifi clésifidansifileifimilieuifideificulture.ifint des nutriments le mode fed-batchifipeutifi sifinéfastes.ifi

1.2.1 La variation desificonditionsifideificultureifi

Les conditions physiologiques sont souvent celles utiliséesifipourifi laifi cultureifi cellulaire.ifi

1.2.1.1 La variation deifilaifitempératureifi

Pour favoriser la croissance cellulaire, la température des cultures cellulairesifiestifi

généralementifimaintenueifiàifi celleifi duifi corps.ifiUneifitempératureifi plusifi élevéeifiinduitifi généralementifi

fin de la culture. Par contre, des conditions légèrement hypothermiques peuvent es autres lignées. Dans les laifi températureifi alorsifi queifi laifi croissanceifi aifi diminué,ifi

production de produit (Bloemkolk,ifiGrayifietifial.ifi1992).ifiUnifipointificommunifideifitoutesifilesifiétudesifisurifi

leifi sujetifi estifi leifi ralentissementifi duifi métabolismeifi enifi conditionsifi hypothermiques.ifi Leifi tauxifi deifi

deifi lactate/ammoniac,ificeifi quiifi aideifi àifi maintenirifi laifi viabilitéifi cellulaire.ifi Cetteifi stratégieifi demeureifi

culture en 2 phases est souvent plusifisouhaitableifiqueifilesificulturesifientièrementifihypothermiquesifi

aideifiàifiprolongerifilaifiviabilitéifidesificellulesifienifilesifimaintenantifidansifilaifiphaseifiG1 duificycleificellulaireifiquiifi

12ifi ifi

1.2.1.2 La variation du pHifi

Le pH joue un rôle critique pour le métabolisme des cellules.ifiLesifiscientifiquesifiquiifiontifi

humaines F2N78, le pH optimal pour la productionifiétaitifideifi6,8ifilorsqueificultivéesifiàifi37oC. Le taux

du pH est donc semblable à celui observé par laifiréductionifideifitempérature.ifiToutefois,ifileifirapportifi

ammoniac

production globale était significativement meilleure à 37°C et à un pH de 6,8 comparativement

plus. Cette disparité entre le pH optimal sel

lignées CHO (Yoon,ifiChoiifietifial.ifi2005;ifiTrummer,ifiFaulandifietifial.ifi2006).ifiFinalement,ifipourificeifiquiifiestifi

mal, mais sifiparamètresifideificultureifi avantificelui-ci.ifi ifi 13ifi ifi

Lignée

cellulaire

Température

hypothermique (°C)

Effets sur la

croissance (µ)

Effets sur le

temps de culture

Effets sur la

productivité spécifique

Effets sur la

production finale Ref.

Humaine

F2N78

2013)ifi

CHO clone

A

CHO clone

B

33ifiDiminuéeifi

ifi

Diminuéeifi

Augmenteifi

ifi

Augmenteifi

Inchangéifi

ifi

Augmenteifi

Semblableifi

ifi

2,5ifi

(KimifiandifiLeeifi

2007)ifi

CHO 30ifi

33ifi
35ifi

Arrêtéeifi

Diminuéeifi

Semblableifi

+5ifijoursifi +3ifijoursifi +1ifijourifi

1,7ifi

1,4ifi

1ifi

Diminuéeifi

Augmentéeifi

Augmentéeifi

(Trummer,ifi

Faulandifietifial.ifi

2006)ifi

CHO 32,5ifi0,33ifi+5-6ifijoursifi1,5ifi2,7ifi(Yoon,ifiChoiifietifi al.ifi2005)ifi 14ifi ifi 1.2.2 La culture en mode batch est limitée par la quantité de nutriments disponibles;ifi lle-ciifi reposeifidoncifi pourraientififavoriserifilaifi croissanceificellulaireifietifi laifi productionifi .ifiEncoreifi demandesifinutritionnelles.ifiion du milieu demeureifidoncififastidieuseifi(Butlerifi2005).ifiEnifi

productionifi deifi déchetsifi métaboliques.ifiIlifi estifi possibleifi deifidévelopperifileifi milieuifi enifi ajoutantifi unifi

composéifiàifilaififoisifietifienifivérifiantifisonifieffetifi(Stoll,ifiMühlethalerifietifi al.ifi1996).ifiParificontre,ificetteifi

méthodeifi estifi extrêmementifi longueifi enifi plusifi deifinégligerifilesifiinteractionsifientreifi lesifi nutriments.ifi

desififluxifi métaboliquesifi(MFA)ifipeutifi eifi

queifi celaifi constitueifi unifi bonifi pointifi deifidépart,ifilaifi MFAifi estifi limitéeifiparifi lesifi méthodesifi deifi mesureifi

CHOifiifi(Zhang,ifiWangifietifial.ifi2013).ifiIabord choisir les supplémentsifiquiifipourraientifiavoirifiunifi

dcentral compositeifidesign) ceifiquiifipermetifideifidéterminerifi

milieuifi commercial.ifiUneifiapprocheifi similaireifiaifiétéifiappliquéeifipourifidiversesifilignéesificellulairesifi

15ifi ifi

1.2.3 Substitution des sources de carboneifi

Le métabolismeifidesifilignéesificellulairesifiimmortaliséesifiestifi caractériséifiparifiuneifi

consommationifi rapideifi duifi glucoseifi etifi deifi laifi glutamine,ifientrainantifi cependantifiaccumulationifideifi

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