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République Algérienne Démocratique et Populaire Université des Frères Mentouri Constantine 1

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Filière Sciences Biologiques

Département de Biologie Appliquée

Support pédagogique destiné aux étudiants de niveau Licence (L3), spécialité " Biotechnologie Microbienne».

Fait par Dr. BENCHIHEUB Meriem

Année universitaire 2019/2020

ENZYMOLOGIE FONDAMENTALE

Généralités sur les enzymes

Introduction

Les enzymes sont les éléments dynamiques qui rendent possibles les transformations chimiques chez les êtres vivants.

Une très forte proportion (probablement la majorité) des protéines déjà caractérisées

possèdent une activité enzymatique. ans la très grande majorité des cas, elle interagit avec un enzyme.

A. Enzyme

- Une très forte proportion (probablement la majorité) des protéines déjà caractérisées

possèdent une activité enzymatique. majorité des cas, elle interagit avec un enzyme. - Les protéines enzymatiques sont des catalyseurs, -à- concentrations très petites, elles augmentent la vitesse des réactions chimiques, sans en inchangée. toujours la même transformation, se produisant sur les mêmes corps chimiques initiaux.

- Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est

déterminée génétiquement : sa conservation dans le génome est favorisée par le besoin

Il y'a au moins une enzyme différente par réaction catalysée, ce qui représente des milliers

d'enzymes par organisme.

Les enzymes sont réparties sur des organites cellulaires différents et peuvent, ainsi, être

qualifiées de "enzymes marqueurs".

On distingue :

* Enzymes extracellulaires (ou exoenzymes) : elles sont synthétisées à l'intérieur de la

cellule, puis sécrétées dans l'espace extracellulaire.

* Enzymes intracellulaires : elles sont synthétisées et utilisées entièrement à l'intérieur de la

cellule où elles sont généralement liées à des particules subcellulaires ou membranes

intracellulaires rendant leur extraction plus difficile.

B. Substrat

C. Produit

· La nouvelle molécule qui résulte de cette transformation est appelée produit.

D. Ligand

Corps chimique ayant une liaison spécifique avec une enzyme

· Toutes les molécules ayant une liaison spécifique avec une protéine sont appelées ligands.

· Pour chaque ligand, il existe au moins un site de fixation sur la protéine qui le reçoit.

E. Cofacteur

Corps chimique intervenant obligatoirement dans une réaction enzymatique : - pour transporter ou compléter un substrat ; - pour accepter un produit ; - comme

minérales habituellement présentes dans les milieux biologiques, à commencer bien sûr par la

Certains cofacteurs sont des molécules plus complexes synthétisées par les cellules :

coenzymes.

F. Coenzymes

Molécule biologique intervenant comme cofacteur indispensable dans la catalyse enzymatique - les coenzymes libres interviennent dans la réaction de manière stoechiométrique ; - les coenzymes liés interviennent dans la réaction de manière catalytique.

2) Nomenclature et classification officielle par

Biochemistry and Molecular Biology)

Numéro EC : 4 nombres séparés par des points et précédés de EC (Enzyme Commission numbers : la Commission des enzymes):

EC x1 . x2 . x3. x4

x1 : type de réaction , le type de fonction du substrat métabolisé x3 : x4 : Le

X1 : type de réaction

1- Oxydoréductases

ĺ-),réductases, peroxydases, oxygénases

FAD+).

2-Transférases

3- Hydrolases (coupure réversible des liaisons ester, éther, peptidique, glycosique, anhydride

acide ou C-

4 - Lyases : Coupure des liaisons

5 - Isomérases : réarrangement structural des isoméres.

6- Ligases : jonction de deux molécules par de nouvelles liaisons covalentes avec hydrolyse

concomitante de l'ATP.

Chapitre 1 : Rappels de cinétique chimique

La réaction enzymatique repend des éléments de cinétique chimique. Toute réaction chimique est définie par sa vitesse. Celle-ci correspond à la quantité de substance qui se

ȝl/s

1. Définition et calcul de vitesse

moléculaire.

A B

Si A disparait(signe () traduit le fait que la concentration de A diminue et que celle de B augmente).

Si B apparait

[A] et [B] sont la concentration de A et B à un instant t. la concentration des réactifs, la température, et Dans notre cas, on se limitera au premier facteur à savoir la concentration des réactifs.

2. Représentation graphique

La représentation graphique de la concentration des réactifs en fonction du temps permet de

déduire la vitesse de réaction. Elle représente la pente de la tangente de la courbe au temps t

(fig.1)

3. Expression mathématique :

La vitesse de réaction est exprimée comme suit : la vitesse est proportionnelle à la concentration des substrats ou produits donc peut

Avec : constante de vitesse

II. Ordre de réaction :

1. Définition :

élevée à une certain puissance, la somme des puissances est appelée ordre de la réaction.

u nombre de molécules réagissantes. Il -même. e supposer que la réaction se fait en plusieurs étapes.

Analyse des résultats cinétiques :

2.1 Cas des réactions non réversibles (irréversible) :

La vitesse de réaction a pour équation la vitesse est constante. est : mole/l /temps (M/min, M/s). des espèces moléculaire transformées.

Réaction 1 :

Exemple :

de la réaction dépend de la concentration de [A]. Au cours de la réaction, la concentration de

A diminue. De ce fait, la vitesse varie

--à-dire min-1 ou s-1.

Les réactions dont

dénaturation thermique des protéines, mutarotation des sucres, -1 s-1. - Cas où les concentrations de A et de B sont égales : [A] = [B].

Mécanisme de la catalyse enzymatique

- Un catalyseur est un facteur physique, physicochimique ou une molécule qui augmente la

- Les propriétés les plus importantes chez les enzymes par rapport à d'autres types de

catalyseurs sont les suivantes : pouvoir de catalyse très élevé ; spécificité ; régulation de l'activité catalytique par des substances naturelles. Il est maintenant nécessaire de savoir par quel mécanisme les enzymes accroissent les vitesses de réactions. Pour cela, nous allons exposer les différentes explications possibles :

5. 1. Effet de proximité et de positionnement :

Ce phénomène peut avoir lieu dans une solution toutes les fois où les molécules se

rencontrent. Par contre dans les réactions enzymatiques, le substrat qui va subir la nt

5. 2. Catalyse covalente :

la réaction non catalysée. Plusieurs exemples de catalyse covalente impliquent une attaque nucléophile

5. 3. Catalyse par les acides et les bases :

De nombreuses réactions de la chimie organique sont catalysées par les acides et les bases.

Dans ces conditions, les ions H+ et OH-

molécules réagissant dans un état de distribution électronique favorisant la réaction. Dans le

cas des enzymes, aux pH usuels de fonctionnement, les concentrations en ions H+ et OH- sont

très faibles et leur participation directe à la catalyse est peu probable. Par contre, les chaines

latérales de plusieurs acides aminés du centre actif possèdent des structures pour agir dans une

catalyse acide ou basique. Les mécanismes que les enzymes utilisent sont classifiés de manière suivante : acide/base. intermédiaire qui permet une réaction plus rapide.

(intermédiaires), pour ioniser les molécules d'eau et les rendre plus nucléophiles, et/ou pour

cacher des charges. transition.

catalytique et sont orientés de telle sorte que l'état de transition est atteint très rapidement.

déstabilise et le rend plus facile à couper. L'enzyme fixe donc préférentiellement le substrat

sous forme d'état de transition. Chapitre 2 : Cinétique enzymatique à un seul substrat et inhibition I. Evolution générale de la réaction enzymatique Dans toute la réaction enzymatique, il est possible de distinguer trois étapes :

1. Phase pré-stationnaire

appareillage spécial. Comme la concentration en substrat est en grand excès par rapport à la formation du complexe (ES) et la production des premières molécules du produit (P).

2. Phase stationnaire ou phase de la vitesse initiale (vi)

Au cours de cette phase, la quantité de produit formée par unité de temps est constante, la

A ce stade de la réaction, la relation est

3. Phase post stationnaire

concentration du complexe (ES) décroit ainsi que la vitesse de la réaction.

II. Schéma de la réaction enzymatique

enzymatiques. Cependant, ces enzymes possèdent un caractère particulier : le phénomène de

saturation.

Lorsque cette dernière est basse, la réaction est du 1er ordre. Quand la concentration de

substrat augmente, la vitess fortes concentrations du substrat, la vitesse devient constante, indépendante de cette concentration, té des complexe enzyme-substrat constitue une étape essentielle dans la réaction catalysée. Ainsi MICHAELIS L. et MENTEN M. ont suggéré que étape avec le substrat pour forme le complexe [ES] et que ce dernier se décompose dans une -MENTEN (KM) exprime la relation mathématique existant entre s par le substrat et la concentration du complexe [ES] prendre une valeur maximale : [ES] = [Et] enzymatique :

Une substance est dite inhibitrice lorsque la réaction se déroule moins vite en sa présence.

Quand la réaction est complè

la cinétique de différente façon.

A. Inhibiteur compétitif :

Chapitre 3 : Cinétique enzymatique à deux substrats

1. Mécanisme ordonné ou séquencé : (bi-bi ordonné)

libre, les phases de la réaction enzymatique au niveau moléculaire se compliquent : on parle de cinétique à deux substrats. -Substrat A forme ensuite un complexe avec le second substrat : Enzyme-Substrat A-Substrat B. ce mécanisme. Exemple de bibi ordonné : la malate déshydrogénase

NAD+ en NADH.

premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Malate se transforme en un complexe Enzyme-NADH-Oxaloacétate ; ce dernier complexe se dissocie en libérant

Expression de la vitesse

A B P Q

E E

EA EAB EPQ EQ

roulement de la réaction.

La vitesse pour A constant et B variable

2. Mécanisme au hasard ou non ordonné : bi-bi aléatoire

e mécanisme, la fixation des deux substrats peut être soit dépendante ou indépendante.

Exemple

s produits seront libérés dans un ordre aléatoire.

De ce fait, on aboutit à une équation de vitesse très compliquée et qui ne suit plus la loi de

MICHAELIS-MENTEN. Cependant, on peut résoudre facilement ce système en admettant quasi- la même manière. -MENTEN. Par rapport au sécrit comme suit :

Chapitre 4 :

Introduction

dans une zone de pH restreinte. Pour beaucoup -elles, le pH optimal a pu être défini. Ex : la pepsine active à pH 2, la phosphatase alcaline active à pH 9- 10.

Le pH peut avoir différents effets :

1. sur la conformation de la protéine,

-même

1. Action du pH s

Il est fréquent que les protéines se dénaturent en milieu acide ou, au contraire, en milieu

alcalin (basique). Cet effet entraine un effondrement de la structure tertiaire et donc à la perte

variation de la charge -, entraine souvent une dénaturation

réversible. Aux pH extrêmes, cette dénaturation est irréversible. On peut vérifier cela,

ps déterminé à différent pH puis la dénaturation. Pour cela, il faut faire appel à des méthodes physico-chimiques complémentaires. Le changement de la structure lié aux variations de pH et entrainant la perte La forme active de la trypsine met en jeu une interaction électrostatique entre un groupement carboxylique et le groupement aminé N-terminal. La protonation et la déprotonation de ces deux groupements suppriment cette interaction. Les pk apparents de ces deux groupes sont 3,7 et 10,1. Variation du pouvoir rotatoire de la trypsine en fonction du Ph.

2. Action du pH sur les paramètres cinétiques

Le pH a un effet sur la vitesse maximale (VmM) da la réaction. Cela peut molécules simultanément. Il est possible de déterminer les groupes ionisables du substrat et leur pK zyme qui sont prises en compte. dans une zone de pH 2.1.

1.1.Equation de vitesse

La vitesse est à tout moment proportionnelle à la quantité du complexe intermédiaire : a. Méthode de DIXON : Cette méthode permet de déterminer, aux pH extrêmes, le nombre de groupement dont la sous forme logarithmique : b. Représentation graphique :

Chapitre 5 : Effet de la température s

1. Quelques notions de thermodynamiques

échanges mécaniques et thermiques avec le milieu extérieur (Figure 1). H veut dire chaleur présente dans une molécule

ǼH :

déroule la réaction (partie étudiée) et le milieu environnant (partie restante)

Les réactions chimiques sont soit exothermiques (la chaleur est dégagée vers le milieu

-à-dire que la système le absorbe la chaleur. Figure 1. Les échanges mécaniques et thermiques entre le système et le milieu extérieur variation du potentiel chimique de chacun de ces constituants. ystème change pour atteindre son minimum lorsque ce système atteint son état Avec R : constante des gaz universelle : 1,987 Kcal /mol

T : température absolue (° kelvin)

K : A température normale 25° RT= 2477 Joule. Mole-1 - pression et à

volume constant ce qui est le cas de la plus part des réactions enzymatiques étudiées et tous

les composés sont dans leur état standard " transfo III. Effet de la température sur la vitesse de la réaction :

1. Définition du Q10 :

50°C croit en général régulièrement et

2. Théories expliquant le mécanisme des réactions :

a théorie des collisions et la théorie des vitesses absolues. a. Théorie des collisions : la cinétique des gaz, le nombre de collision croit avec la températu

BOLTZMANN :

Où ǻേ -à-

Où Z : représente le nombre de collisions par unité de temps et de volume à une température

donnée P : la fraction de molécule déclenchant la réaction P-Z : est un facteur non mesurable, il est remplacé par le facteur A. b. Théorie des vitesses absolues :

Cette théorie tient compte également des collisions des molécules et implique surtout le

passage des molécules par des états intermédiaires instable ayant tendance à évoluer

spontanément vers des états voisines plus stable.

Un développement de la théori

BOLTZMANN montre que la vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration du

complexes activé et que les facteurs de proportionnalité sont identiques pour toutes les

réactions :

Ln E/E0 =f(tps)

T0,5 = Ln2/ki

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