[PDF] Signalisation moléculaire par le système de réparation des

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AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuvŽ par le jury de soutenance et mis ˆ disposition de l'ensemble de la communautŽ universitaire Žlargie. Il est soumis ˆ la propriŽtŽ intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de rŽfŽrencement lors de lÕutilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pŽnale.

Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr

LIENS Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10

Membres du jury:

Rapporteurs: M. Philippe Mazodier Directeur de Recherche Institut Pasteur, Paris M. Fabrice Confalonieri Professeur, Université Paris-Sud 11 Examinateurs: Mme. Bénédicte Michel Directrice de Recherche CNRS, Paris M. François Lecointe Chargé de Recherche INRA, Jouy-en-Josas Directeur de thèse: M. Pierre Leblond Professeur, Université de Lorraine

Co-encadrant de thèse: Mme. Annabelle Thibessard Maître de Conférence, Université de Lorraine

Vers la compréhension des mécanismes de

ǯStreptomyces :

ǯ Thèse

en Ecotoxicité, Biodiversité, Ecosystèmes et soutenu publiquement le 23 septembre 2014 par Lingli ZHANG Ecole doctorale RP2E (Ressources, Procédés, Produits et Environnement) Laboratoire DynAMic ȂUMR UL/INRA 1128 ȂIFR EFABA Faculté des Sciences et Technologies - 54506 Vandoeuvre-lès-NancyCEDEX 1

Remerciements

Merci pour la qualité de son encadrement et la pertinence de ses remarques. remercie pour la qualité de son encadrement, sa grande disponibilité, également

François Lecointe

pour avoir accepté de juger ce travail. Je remercie vivement Claire Bertrand pour le soutien scientifique, Emilie Piotrowski pour son aide à la réalisation technique de ce travail et Ludovic Chipot pour son été vraiment ravie de pouvoir travailler dans une ambiance aussi bonne. Je remercie ma famille, Papa, Maman et mes beaux parents pour leur soutien. Et enfin un grand merci à Zhenghui, mon mari pour son soutien de tous les jours et même saveur sans vous. 2

Liste des abréviations

A-EJ

AEP Alternative end-joining

Archaeo eukaryotic primase

BER Base excision repair

BIR Break-induced replication

BLM Bloom syndrom

cSDR Constitutive-stable DNA replication

DSB Double strand break

DSBR Double strand break repair

ECF Extracytoplasmic sigma factor

eGFP EMS Enhanced green fluorescent protein

Ethyle méthanesulfonate

GOC Gene order conservation

IF Initiation factor

iSDR Induced-stable DNA replication

MGMT 6-O-methylguanine DNA methyltransferase

MLSA Multilocus sequence analysis

MMC Mitomycine C

MMR DNA mismatch repair

MRN Mre11/Rad50/Nbs1 complexe

MRX Mre11/Rad50/Xrs2 complexe

NER Nucleotide excision repair

NHEJ Non-homologous end joining

RDR Recombination-dependent replication

RFR Replication fork reversal

RH Recombinaison homologue

RI Recombinaison illégitime

ROS Reactive oxygen species

RPA Replication protein A

RSS Recombination signal sequence

SAP SAF-A/B, Acinus and PIAS

SD Shine-Dalgarno

SDSA Synthesis-dependent strand annealing

SF1 Superfamille 1

SSA Single-strand annealing

SSB Single-stranded DNA-binding protein

TIR Terminal inverted repeat

3

Sommaire

Remerciements ............................................................................................................................................ 1

Liste des abréviations ............................................................................................................................... 2

Sommaire ....................................................................................................................................................... 3

1. Introduction ...................................................................................................................................... 6

6.1. Réplication conservative, mutations et évolution ........................................................................... 6

6.2. Sources des mutations ................................................................................................................................ 8

1.2.1. Les erreurs de réplication ............................................................................................................. 8

1.2.3. Les lésions induites par les agents mutagènes .................................................................. 10

1.2.5. Le système SOS............................................................................................................................... 14

1.2.6. Le transfert horizontal ................................................................................................................ 15

6.3. Mécanismes de réparation des cassures double-brin ................................................................. 20

1.3.2. Multiplicité des mécanismes de réparation des DSB ...................................................... 21

6.4. Pourquoi

1.4.1. Une organisation chromosomique originale ...................................................................... 48

1.4.2. ǯ‹•-ƒ"‹Ž‹-± ‰±±-‹“—‡ ...Š‡œ Streptomyces ........................................................................... 49

1.4.3. Région de synténie dégénérée ................................................................................................. 51

1.4.4. Les recombinaisons chez Streptomyces ................................................................................ 52

2. Objectifs de la thèse .................................................................................................................... 54

3. Résultats .......................................................................................................................................... 56

3.1. La recombinaison homologue .............................................................................................................. 56

3.1.1. Les gènes adnAB

dans les génomes de Streptomyces ...................................................... 56

3.1.2. adnAB

est essentiel chez les Streptomyces .......................................................................... 61

3.1.4. adnAB

affecte le phénotype de Streptomyces ........ 75

3.2. La recombinaison illégitime .................................................................................................................. 82

3.2.1. Identification in silico

ambofaciens ............................... 86

4. Discussion ..................................................................................................................................... 103

4.1. ǯŠ±Ž‹...ƒ•‡-nucléase AdnAB, la recombinaison homologue et la survie chez les

Streptomyces .........................................................................................................................................................103

4.1.1. ǯŠ±Ž‹...ƒ•‡-nucléase AdnAB est essentielle chez les Streptomyces ...........................103

4.1.2. Le locus adnAB

4.1.3. La

réponse SOS est-elle indépendante de LexA chez les Streptomyces ? ...............113 S.

ambofaciens : implication dans la réparation des DSB ....................................................................117

4

4.2.1. KuA et KuC sont impliquées dans la résistance aux stress génotoxiques .............117

4.2.2. Les protéines Ku jouent-elles un rôle dans la protection des télomères chez les

Streptomyces ? .............................................................................................................................................120

4.2.3. Caractérisation des homologues LigD .................................................................................121

4.3. Compétition entre RH et NHEJ chez Streptomyces .....................................................................123

4.3.1. RH et NHEJ

: entre collaboration et compétition chez les eucaryotes ....................123

4.3.2. Et chez les bactéries

? ................................................................................................................125

4.4. Recombinaison

et évolution du génome des Streptomyces .....................................................127

5. Perspectives ................................................................................................................................. 130

6. Matériel et Méthodes ................................................................................................................ 132

6.1. Souches bactériennes, plasmides et BAC .......................................................................................132

6.1.1. Souches bactériennes ................................................................................................................132

6.1.2. Plasmides

6.1.3. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ..............................................................................135

6.1.4. Cosmides ........................................................................................................................................136

6.2. Condition de cultures .............................................................................................................................136

6.3. Construction des plasmides, cosmide et BAC recombinants ..................................................137

6.5.1. Les constructions pour la mutagenèse ...............................................................................137

6.5.2. Les plasmides recombinants pour les expériences de complémentation ............140

6.5.3. Les plasmides recombinants utilisés pour la localisation des homologues de

Ku 141

6.4. Extrac-‹‘ †ǯAB ‡- †ǯA2B ..................................................................................................................143

coli et de Streptomyces ......................................................143 coli ..................................................................................143

6.8.2. Conjugaison inter-générique ..................................................................................................

143

6.6. Tests de PCR quantitative et PCR semi-quantitative .................................................................144

6.7. 4‡•-• †ǯƒ...-‹˜‹-± —...Ž±ƒ•‡ .......................................................................................................................144

6.8. Caractérisation phénotypique ............................................................................................................145

6.8.1. Test de viabilité cellulaire ........................................................................................................145

6.8.2. Exposition aux rayonnements UV.........................................................................................145

6.8.3. Traitement à la mitomycine C ................................................................................................145

6.8.4. Exposition aux rayonnements gamma ................................................................................146

6.9. Observation au microscope

à épifluorescence des souches de Streptomyces .................146

7. Références .................................................................................................................................... 152

5

INTRODUCTION

Introduction-Réplication conservative, mutations et évolution 6

1. Introduction

6.1. Réplication conservative, mutations et évolution

génétique de génération en génération. Elle est, de par son mécanisme génétique. Néanmoins, la diversité des organismes vivants qui nous entourent et de leurs caractéristiques morphologiques est remarquable, tout comme le sont leurs évolutionniste. Ainsi des variations interindividuelles sont observées chez les domestications. Les organismes vivants présentent donc la capacité spontanée de

varier. De plus, certaines de ces variations peuvent être fixées héréditairement,

...ǯ‡•--à-dire transmise à la descendance par la reproduction sexuée. A la fin du 19ème

entre conservation et variation génétique. Introduction-Réplication conservative, mutations et évolution 7 En 1901, Hugo de Vries (1848-1935) a publié un ouvrage intitulé " Die M utationstheorie». Dans ce volume il nomme mutation les variations brusques et mutationnisme voit le jour. Selon cette théorie, les mutations peuvent expliquer à théorie de Darwin qui donne à la sélection naturelle un rôle clé dans le processus de diversification des espèces. Avec les progrès de la génétique des populations dans les années 1930, mutations et sélection naturelle trouvent leur place dans la théorie que les mutations sont la source de la variabilité génétique, et que dans certaines conditions, la sélection naturelle " fait le tri clairement démontré dans des modèles bactériens par Luria et

Delbrück (1943),

Newcombe (1949) et Lederberg and Lederberg (1952).

Introduction-Sources des mutations

8

6.2. Sources des mutations

les mutations peuvent être classées en trois catégories : (1) les mutations ou plusieurs nucléotides, insertion et délétion) ; (2) des réarrangements inversion, duplication, fusion et fission chromosomique) ; (3) les mutations Les mutations sont principalement introduites par les deux mécanismes clés de

1.2.1. Les erreurs de réplication

L a réplication est un mécanisme hautement fidèle qui repose sur la synthèse du ; le mécanisme est appelé hémisynthèse (Meselson et grâce à deux niveaux de contrôle d it " pré-synthétique », est capable de sélectionner le bon nucléotide à incorporer à chaque position, le second, dit post-synthétique », permet une correction par délétion du nucléotide inadéquat ‹•‘Žƒ-• †ǯE. coli entre 10-8 et

10-10 erreur par paire de bases. La déficience de cette

et confère donc un phénotype hypermutateur (Degnen et

Cox, 1974; Michaels et al.,

1990).

Introduction-Sources des mutations

9 Des altérations de la structure chimique des bases de ǯ plus classiques sont la désamination et la dépurination/dépyrimidination. Le premier phénomène correspond à la perte du groupement amine (position 4), et de cette base modifiée. La dépurination/dépyrimidination correspond à la perte du mais sont néanmoins pré-mutagènes, et peuvent entraîner une erreur de Les fréquences de ces lésions spontanées sont faibles mais leur accumulation 100
-500 déaminations spontanées par jour et par celǯǡ ǯͻͲͲͲ-10000 dépurinations spontanées (Lindahl et Nyberg, 1972). Cela en fait la première cause endogène d'altération de l'ADN. Certains nucléotides ou contextes nucléotidiques sont plus propices à ces dommages : ainsi, les cytosines mé thylées en position 5 (5mC) constituent des points chauds de transition. En effet, par désamination spontanée les 5mC se transforment en thymine. Pour cause, il ponctuelles (cytosine vers thymine) vont se produire à hautes fréquences aux positions des 5mC.

Introduction-Sources des mutations

10

1.2.3. Les lésions induites par les agents mutagènes

en deux catégories : (1) les agents chimiques tels que les agents alkylants, les agents in tercalants, les analogues des bases et (2) les agents physiques comme des radiations ionisantes, des rayonnements UV. Certains agents induisent des en lui transférant un groupe méthyle ou éthyle. Les radiations ionisantes induisent plus de 70 types de lésions oxydatives différentes dont des cassures simple et double brin. Les rayons UV provoquent la formation de dimères de bases adjacentes (notamment des thymines). Certains agents perturbent la structure de la double les paires de bases. Par ailleurs, les analogues des bases peuvent leurrer la machinerie réplicative en se substituants aux bases de l'ADN lors de la réplication et induire des mutations aux cycles réplicatifs ultérieurs.

1.2.4.

Les lésions en quantités trop importantes vont entraîner la mort cellulaire, et ne présentent aucune conséquence évolutive. En revanche, lorsque ces dommages vont être endigués, la nature du mécanisme de prise en charge va déterminer le caractère correct ou incorrect de la réparation, et donc ses conséquences sur le Les paragraphes suivants présenteront les mécanismes principaux de réparation de

Introduction-Sources des mutations

11

1.2.4.1. Réparation par excision

Réparation par excision de base

alkylation. La réparation par excision de base (BER) est communément utilisée pour éliminer par excision les bases endommagées. Dans ce processus, une ADN glycosylase reconnaît ǯǡ une activité endonucléasique clive le désoxyribose. Une ADN polymérase remplit à nouveau ǯcomplémentaire comme matrice. Enfin, une ADN ligase suture le brin réparé. Les mutations dans les acteurs de la réparation par BER entraînent une augmentation de la fréquence de mutations chez de nombreux organismes (Reagan et al., 1995; Denver et al., 2006; Kurthkoti et al., 2008) (figure 1).

Figure 1. ǯ (BER) chez E. coli

Introduction-Sources des mutations

12

YRéparation par excision de nucleotides

L a réparation par excision du nucléotide (NER) est un mécanisme plus flexible que endommagé. Le principe est la reconnaissance de la perturbation engendrée par le libre puis ǯǯȋ

2). Chez E.

ǯ ǯuvrD augmente la fréquence de mutations spontanées par un facteur 100 (Washburn et

Kushner, 1991; Hall, 1995; LeCuyer et al., 2010).

Figure 2. ǯȋȌE. coli

Introduction-Sources des mutations

13

YRéparation des mésappariements

Un troisième système de réparation par excision reconnaît les bases qui, bien que mécanisme spécifique, post-réplicatif, Ǯ ǯ MR originelle (figure 3). La discrimination des brins, parental et néosynthétisé, se fait grâce au caractère méthylé du brin parental. La méthylation est un phénomène post-réplicatif. Chez E. coli, les protéines MutS, MutL et MutH sont les acteurs Figure 3. Modèle de la réparation des mésappariements (MMR) chez E. coli

Le processus de réparation par MMR commence par la reconnaisance des mésappariements par la protéine

MutS. Ensuite, MutL est recruté pour former le complexe MutSLH avec MutH déjà fixé sur le site GATC. Sous

cette forme complexée, MutH est activé et clive le brin non méthylé au niveau du site GATC. Puis, une

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