[PDF] Réparation de lADN par une protéine `` Radical-SAM : Etude de la

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UNIVERSITE JOSEPH FOURIER - GRENOBLE I

SCIENCES ET GEOGRAPHIE

ECOLE DOCTORALE CHIMIE ET SCIENCES DU VIVANT

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L"UNIVERSITE JOSEPH FOURIER

Discipline : Chimie / Biologie

Présentée et soutenue publiquement par

Alexia CHANDOR-PROUST

Le 28 novembre 2008

Réparation de l"ADN par une protéine " Radical-SAM »

Etude de la Spore Photoproduct Lyase

Composition du jury

Président : Pr. Alain FAVIER

Rapporteurs: Dr. Pascale CLIVIO

Dr. Bertrand CASTAING

Examinateur : Pr. Olivier PLOUX

Directeur : Dr. Mohamed ATTA

Co-directeur : Pr. Marc FONTECAVE

Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux

CEA - Grenoble

iRTSV/LCBM - CNRS - Université Joseph Fourier 3

RESUME

Chez les spores de bactéries, le photoproduit le plus abondant formé dans l"ADN irradié par les UV est un dimère de thymines appelé Photoproduit des spores (SP, 5-(a-thyminyl)-

5,6-dihydrothymine). Au début de la germination, ce photoproduit est spécifiquement réparé

par une enzyme, la Spore Photoproduct Lyase (SPL), régénérant les deux résidus thymine

originaux. Cette enzyme est une protéine Fe-S qui appartient à la famille des " Radical-

SAM ». Les protéines de cette famille d"enzymes possèdent un centre [4Fe-4S], coordiné par

3 cystéines conservées organisées selon le motif CxxxCxxC, et utilisent la S-

Adénosylméthionine comme cofacteur. Elles fonctionnent toutes selon un mécanisme

radicalaire, initié par la formation du radical 5"-désoxyadénosyle issu de la coupure

homolytique de la S-Adénosylméthionine par le centre [4Fe-4S] réduit. Dans ce travail, nous avons effectué une caractérisation biochimique et spectroscopique des SPL de Clostridium acetobutylicum et Bacillus subtilis. Par ailleurs, nous avons synthétisé un substrat minimum sous la forme d"un dinucléoside monophosphate appelé SPTpT, pour lequel une

caractérisation structurale par RMN a été réalisée. Le SPTpT est reconnu et efficacement

réparé par l"enzyme, ce qui nous a permis d"obtenir de nouvelles informations sur le

mécanisme enzymatique de réparation. Enfin, la séquence primaire des SPL contient une 4 e

cystéine conservée, essentielle à la réparation, mais qui n"est pas impliquée dans la

coordination du centre [Fe-S]. Nous nous sommes intéressés au rôle de cette cystéine dans le

mécanisme de réparation grâce à l"étude biochimique et enzymatique du mutant SPLC141A.

MOTS CLES : spore, ADN, lésion de l"ADN, photoproduit, réparation de l"ADN, SPL,

Radical-SAM, centre fer-soufre

TITLE : Study of Spore Photoproduct Lyase, a "Radical-SAM" enzyme involved in DNA repair

ABSTRACT

The major photoproduct of UV-irradiated DNA from bacterial spores is 5-(a-thyminyl)-

5,6-dihydrothymine, a unique thymine dimer called Spore Photoproduct (SP). At the

beginning of germination, this photoproduct is specifically repaired by the Spore Photoproduct Lyase (SPL), regenerating the two thymine monomers. SPL belongs to a family of iron-sulfur enzymes named " Radical-SAM ». In this family, proteins have a [4Fe-4S] cluster, chelated by three cysteines highly conserved constituting the "Radical-SAM" motif CxxxCxxC, and use S-Adenosylmethionine as a cofactor. They all use a radical based mechanism, initiated by 5"-deoxyadenosyl radical formation, derived from the homolytic cleavage of S-Adenosylmethionine by the reduced [4Fe-4S] cluster. Here, we have characterized, by biochemical and spectroscopic methods, the recombinant SPL from Clostridium acetobutylicum or Bacillus subtilis. Furthermore, we have synthesized a novel substrate called SPTpT under the form of a dinucleoside monophosphate. The structural characterization of this compound, using NMR spectroscopy, has been carried out. Moreover, this substrate is recognized and efficiently repaired by this enzyme, providing a convenient way to investigate the repair mechanism. Finally, the sequence of all SPL contains a fourth well-conserved cysteine. Site-directed mutagenesis shows that this residue is strongly involved in the repair mechanism but not in the cluster formation. The role of this cysteine

141 in the catalytic mechanism has been studied.

KEYWORDS: spore, DNA, DNA lesion, photoproduct, DNA repair, SPL, Radical-SAM, iron-sulfur cluster

Remerciements

7 Je tiens tout d"abord à remercier Marc Fontecave de m"avoir accueillie au sein du Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Rédox Biologiques devenu le Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux, de m"avoir fait confiance malgré les connaissances plutôt légères que j"avais en biochimie en octobre 2005. Je te remercie pour ta disponibilité, les

réunions de travail très motivantes et les discussions scientifiques très enrichissantes que nous

avons eues. Je remercie également mon directeur de thèse Mohamed Atta ; pour m"avoir permis d"effectuer cette thèse et pour ton encadrement au quotidien. Mes remerciements vont également à Sandrine Ollagnier-de-Choudens, si impliquée

dans ce sujet passionnant même si ça n"était pas " officiel ». Merci de t"être impliquée dans

ma formation pratique en biochimie, merci pour tes conseils et ton suivi régulier, jusqu"à la rédaction de ce manuscrit et pour ta disponibilité lors de la préparation de ma soutenance. Je désire ensuite exprimer mes plus chaleureux remerciements à Thierry Douki et Didier Gasparutto, pour m"avoir initiée à la chimie et la photochimie particulière de l"ADN. Merci pour votre accueil dans votre laboratoire, pour votre gentillesse qui m"ont permis de me sentir

à l"aise dans ce laboratoire que j"ai fréquenté par intermittence, et surtout pour m"avoir appris

tant de choses.

Je tiens également à remercier les différentes personnes qui ont collaboré à mon travail :

Tout d"abord Serge Gambarelli, merci pour ta pédagogie en ce qui concerne les explications des principes de la RPE et de la spectroscopie Hyscore ; Je remercie le laboratoire de Résonnances Magnétiques du CEA, en particulier Michel Bardet, Jean-Marie Mouesca, Claire Mantel et Pierre-Alain Bayle pour leur implication dans le projet et leurs immenses compétences qui nous ont permis de répondre à une question cruciale sur le sujet ;

Yvain Nicolet, je te remercie d"avoir accepté d"essayer de cristalliser la SPL, et je

m"excuse auprès de toi de ne pas avoir pu te donner de protéine suffisamment pure. J"espère que cela aboutira un jour. Je souhaite aussi remercier tous les membres du jury, Alain Favier, Pascale Clivio, Bertrand Castaing et Olivier Ploux, pour avoir accepté de juger mon travail. Vient le tour de remercier tous les membres du LCBM, sans qui mes trois années passées au laboratoire n"auraient pas été si sympatiques !

Remerciements

8 Merci à tous, chimistes ou biochimistes, pour les discussions scientifiques que nous avons pu avoir (Etienne, Vincent N, Vincent A, Stéphane, Olivier, Caroline Marchi, Cathy,

Fabien) et pour les moments de détente au café. Nico, je te remercie pour les premières

manips de RMN que nous avons faites ensemble et aussi pour les discussions prolongées devant la porte du labo de RMN. Des " Special Thanks » pour " Les Filles », qui plus que des collègues sont devenues de

véritables amies, Maïté avec qui j"ai partagé beaucoup plus qu"un bureau ; Emilie ta

gentillesse n"a pas d"égal ; Carole, merci pour ce que tu m"as appris en purification de

protéines et bien plus (pas seulement professionnellement), ta bonne humeur et ta tchatche ; la

mystérieuse Carine et tes expressions spontanées devenues célèbres ; Guni pour m"avoir

permis de pratiquer un tout petit peu l"allemand pendant 2 ans ; Chantal pour être à la fois une

maman et une mamie de substitution ; Adeline pas seulement pour ma mosaïque, mais aussi

pour partager mes goûts télévisuels !! Je ne vous remercierai jamais assez pour tous les bons

moments passés ensemble au labo et à l"extérieur, pour mon enterrement de vie de jeune fille,

pour les surprises lors de mon mariage, pour mes cadeaux de thèse, pour m"avoir soutenue dans les moments de doute, etc... vous êtes géniales. Je n"oublierai pas Sigolène (je compte sur toi pour perpétuer le fameux Chimie Pariiiiiis) ; Florence, Pascal et son humour que j"apprécie beaucoup, Eric pour ses potins,

Stéphane Mouret pour m"avoir formée à l"utilisation du spectro de masse et pour ses

nombreux conseils, Silke, Cécile, Simon, Pierre-André et tous ceux qui ne sont plus au

LCBM, Caro Ranquet, Yohan, Aziz pour les bons moments passés au labo. Pour terminer, je voudrais remercier ma famille, Edouard, Valentin et mes parents pour votre amour, votre confiance et votre soutien permanent ; ma grand-mère Nicole, Jean et Odile pour tout ce que vous avez fait pour moi ; Jacques et Martine Proust, qui avez accepté qu"un docteur de plus entre dans votre famille et enfin et surtout Alexandre qui a accepté de me suivre à Grenoble et est devenu mon mari pendant cette thèse. Je te remercie pour ton amour incommensurable, pour toujours croire en moi et pour m"avoir soutenue même dans

certains moments de doute, merci pour tout ce que tu fais pour moi et pour ce que tu

m"apportes au quotidien. Table des matièresTable des matièresTable des matièresTable des matières

Table des matières

11

Abréviations et notationsAbréviations et notationsAbréviations et notationsAbréviations et notations_________________________________________15

I. Les spores de bactéries _______________________________________________24 I.1. Structure et caractéristiques des spores_____________________________________ 25 I.2. Sporulation __________________________________________________________ 28 I.3. Germination__________________________________________________________ 29 II. Agressions UV et réparation de l"ADN__________________________________30 II.1. Rappels sur l"ADN (structure, rôle et nomenclature)__________________________ 30 II.2. Les lésions de l"ADN __________________________________________________ 37 II.3. Réparation des lésions photoinduites_______________________________________ 44 II.4. Le Photoproduit des spores ______________________________________________ 48 III. La Spore Photoproduct Lyase _______________________________________63 III.1. Mise en évidence d"un processus de réparation spécifique ______________________ 63 III.2. La Spore Photoproduct Lyase ____________________________________________ 64 IV. Les protéines de la famille " Radical-SAM » ___________________________67 IV.1. Les protéines à centre [Fe-S]_____________________________________________ 67 IV.2. La famille des " Radical-SAM »__________________________________________ 68 IV.3. La Spore Photoproduct Lyase : Mécanisme proposé___________________________ 74 V. Objectifs de la thèse__________________________________________________77

Matériels et MéthodesMatériels et MéthodesMatériels et MéthodesMatériels et Méthodes____________________________________________79

I. Matériels biologiques ________________________________________________81 I.1. Souches bactériennes___________________________________________________ 81 I.2. Vecteur de surexpression________________________________________________ 82 I.3. Milieux de culture _____________________________________________________ 82 II. Méthodes de biologie moléculaire ______________________________________83 II.1. Introduction d"ADN dans E. coli__________________________________________ 83 II.2. Amplification par PCR - Mutagenèse dirigée ________________________________ 84 III. Méthodes biochimiques_____________________________________________86 III.1. Obtention des protéines_________________________________________________ 86 III.2. Reconstitution du centre [Fe-S] de la SPL __________________________________ 88 III.3. Analyses biochimiques _________________________________________________ 89

Table des matières

12 III.4. Libération du Photoproduit des spores de l"ADN par voie enzymatique ___________ 93 III.5. Tests enzymatiques ____________________________________________________ 95 IV. Méthodes Chimiques_______________________________________________98 IV.1. Produits chimiques ____________________________________________________ 98 IV.2. Synthèses____________________________________________________________ 98 V. Techniques physico-chimiques - Méthodes analytiques___________________105 V.1. Spectrophotométrie UV-visible__________________________________________ 105 V.2. Spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE)_______________ 107 V.3. Spectroscopie Hyscore ________________________________________________ 109 V.5. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ___________________ 114 V.6. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) en phase inverse__________ 118 V.7. Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ________________________________________________________ 119 V.8. Spectrométrie de masse MALDI-TOF ____________________________________ 121

Partie I Expression, Purification et Caractérisation de la Spore Photoproduct Partie I Expression, Purification et Caractérisation de la Spore Photoproduct Partie I Expression, Purification et Caractérisation de la Spore Photoproduct Partie I Expression, Purification et Caractérisation de la Spore Photoproduct

Lyase

LyaseLyaseLyase

Chapitre 1 : Résultats___________________________________________129 I. Obtention des protéines (sauvages et mutées) de Bacillus subtilis et Clostridium I.1. Expression et purification des protéines recombinantes en aérobiose_____________ 129 I.2. Quantification du Fer et du Soufre _______________________________________ 132 I.3. Purification de la SPL recombinante de C. acetobutylicum en anaérobiose________ 132 I.4. Reconstitution des protéines purifiées en aérobiose__________________________ 133 I.5. Caractérisation biochimique de la SPL de B. subtilis reconstituée _______________ 134 II. Caractérisation spectroscopique du centre [Fe-S]________________________134 II.1. Caractérisation du centre [Fe-S] après reconstitution _________________________ 134 II.2. Caractérisation par RPE du centre après oxydation___________________________ 138

II.3. Caractérisation du centre [Fe-S] à l"état réduit ([4Fe-4S]1+)____________________ 139

Chapitre 2 : Discussion _________________________________________143

Partie II Synthèse du Photoproduit des sporesPartie II Synthèse du Photoproduit des sporesPartie II Synthèse du Photoproduit des sporesPartie II Synthèse du Photoproduit des spores_______________________147

Chapitre 1 : Résultats___________________________________________150

Table des matières

13 I. Synthèse du SPTpT_________________________________________________150 I.1. Préparation du dinucléoside monophosphate TpT (thymidylyl-(3"-5")-thymidine)___ 150 I.2. Préparation du Photoproduit des spores SPTpT (thymidylyl-(3"-5")-thymidine) ____ 152 I.3. Détermination de la configuration absolue du C5 du SPTpT par RMN ___________ 155 II. Obtention du 11mer contenant le Photoproduit des spores, simple et double brin 166
II.1. Synthèse de l"oligonucléotide 11mer GCGAATTCACG et de son complémentaire _ 167 II.2. Irradiation UV-C - Incorporation du SP dans l"oligonucléotide_________________ 168 II.3. Séquençage de l"oligonucléotide 11merSP _________________________________ 169 II.4. Hybridation du 11merSP avec le 11mercomp________________________________ 171 Chapitre 2 : Discussion _________________________________________172

Partie III Partie III Partie III Partie III Quel mécanisme pour la SPLQuel mécanisme pour la SPLQuel mécanisme pour la SPLQuel mécanisme pour la SPL ????___________________________177

Chapitre 1 : Résultats___________________________________________180 I. Activité et spécificité de la SPL sauvage de Bacillus subtilis________________180 II. Activités de la SPL sauvage de Bacillus subtilis avec le SPTpT _____________181 II.1. Cinétique de l"activité de réparation du Photoproduit des spores ________________ 181 II.2. Détermination des paramètres cinétiques Km et Vmax de la SPL sauvage de B. subtilis pour le substrat SPTpT_______________________________________________________ 182 II.3. Mesure de l"activité de réductolyse de la S-Adénosylméthionine________________ 183 III. Activités de la SPLBsC141A de Bacillus subtilis en présence du SPTpT ___185 III.1. Activité de réparation du SPTpT par la SPLBsC141A de B. subtilis _____________ 185 III.2. Activité de réductolyse de la SAM de la SPLBsC141A _______________________ 187 III.3. Identification des produits issus de l"incubation de la SPLBsC141A avec le substrat SPTpT par spectrométrie de masse MS2 _________________________________________ 188 III.4. Modélisation chimique de la formation des produits A et B____________________ 193 IV. Détermination du rôle de la cystéine 141 dans la réaction enzymatique____197

IV.1. Transfert de deutérium par la S-Adénosylméthionine marquée en position 5"______ 198

IV.2. Marquage de la SPL par du deutérium ____________________________________ 199 V. Test d"activité de la SPL de B. subtilis avec le substrat oligonucléotidique ___204 Chapitre 2 : Discussion _________________________________________206 I. Activité de réparation de la SPL sauvage _______________________________206 I.1. Le substrat SPTpT____________________________________________________ 206 I.2. Le substrat oligonucléotidique___________________________________________ 207

Table des matières

14 II. Activité de réductolyse de la SAM_____________________________________208 III. Informations mécanistiques obtenues grâce à l"étude de la SPL mutée ____210

Conclusion généraleConclusion généraleConclusion généraleConclusion générale____________________________________________215

Table des illustrationsTable des illustrationsTable des illustrationsTable des illustrations__________________________________________221

Table des figures _______________________________________________________223 Table des schémas ______________________________________________________229 Table des tableaux______________________________________________________233

Références bibliographiquesRéférences bibliographiquesRéférences bibliographiquesRéférences bibliographiques______________________________________235

1. Chandor, A., Berteau, O., Douki, T., Gasparutto, D., Sanakis, Y., Ollagnier-de-

Choudens, S., Atta, M., and Fontecave, M. (2006) J Biol Chem 281, 26922-26931

2. Chandor, A., Douki, T., Gasparutto, D., Gambarelli, S., Sanakis, Y., Nicolet, Y.,

Ollagnier-De-Choudens, S., Atta, M., and Fontecave, M. (2007) C. R. Chim. 10, 756-765

3. Chandor-Proust, A., Berteau, O., Douki, T., Gasparutto, D., Ollagnier-de-Choudens,

S., Fontecave, M., and Atta, M. (2008) J Biol Chem 283, 36361-36368

4. Mantel, C., Chandor, A., Gasparutto, D., Douki, T., Atta, M., Fontecave, M., Bayle, P.

A., Mouesca, J. M., and Bardet, M. (2008) J Am Chem Soc 130, 16978-16984 Abréviations et Abréviations et Abréviations et Abréviations et notations notationsnotationsnotations

Abréviations et notations

17 (6-4)PP Adduit pyrimidine(6-4)pyrimidone

A Absorbance

ADN Acide désoxyribonucléique

Ado ???? radical 5"-désoxyadénosyle AdoH 5"-désoxyadénosine hydrogénée

APS Ammonium persulfate

ARN Acide ribonucléique

BET Bromure d"Ethidium

CaCl

2 Chlorure de Calcium

CPD Dimère cyclobutabipyrimidique

Cys (C) Cystéine

DMPD DiMéthyl Phénylène Diamine

DO Densité Optique

DTT Dithiothréitol

E Energie

EDTA Acide Ethylène Diamine TétraAcétique

ESI Ionisation par Electrospray

e eee Coefficient d"absorption (ou extinction) molaire

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

G Gauss

GHz Gigaherz

h Constante de Planck

HCl Acide Chlorhydrique

HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance

Hz Hertz

I Spin nucléaire

IPTG IsoPropyl-b-D-ThioGalactopyranoside

K Kelvin

kDa Kilodalton

LB Luria Bertani

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation mL Millilitre

Abréviations et notations

18 mM Millimolaire mV Millivolt

μL Microlitre

μM Micromolaire

NaCl Chlorure de Sodium

NAD Nicotinamide Adénine Dinucléotide

NADPH Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate, forme réduite ng Nanogramme NH

4Cl Chlorure d"ammonium

Ni-NTA Nickel- Acide Nitilotriacétique

nm Nanomètre n Fréquence

OD Optical Density

pb Paire de Bases

PCA Acide Perchlorique

PCR Polymerase Chain Reaction (Réaction de Polymérisation en Chaîne) pmol picomole ppm Parties par millions

RMN Résonance Magnétique Nucléaire

RPE Résonance Paramagnétique Electronique

Rpm Tours par minute

Rt Temps de rétention

S ? Radical thiyle

SAM (AdoMet) S-Adénosylméthionine

SDS-PAGE Sodium Dodécyl Sulfate polyAcrylamide Gel Electrophoresis

SP Photoproduit des spores

SPL Spore Photoproduct Lyase

SPTpT Photoproduit des spores sous la forme d"un dinucléoside monophosphate

T1 Temps de relaxation spin - réseau

T2 Temps de relaxation spin - spin

TEMED N, N, N", N"-TétraMéthylEthylène Diamine

Thy Thymine

Thd Thymidine

Abréviations et notations

19

TOF Time Of Flight (Temps de vol)

TpT Thymidily-(3"-5")-thymidine

UV Ultra Violet

w www Vitesse angulaire

Introduction

23
Les spores de bactéries sont des organites au métabolisme ralenti voire quasi-inexistant

ayant des propriétés très particulières. Ainsi sont-elles extrêmement résistantes à toutes sortes

d"agressions extérieures (températures élevées, irradiations UV et gamma, vide, agents

chimiques). Cette résistance confère aux spores une longévité extraordinaire, qui peut aller

jusqu"à plusieurs milliers d"années (Nicholson et al., 2002). Les agressions extérieures peuvent fortement endommager l"acide désoxyribonucléique ou ADN, contenu dans toutes les cellules et support de l"information génétique, qu"il est donc primordial pour un organisme vivant de protéger. Les spores de bactéries ont ainsi acquis des

mécanismes leur permettant à la fois de protéger leur matériel génétique, en vue de leur

survie, et également de réparer les dommages que l"ADN aurait pu subir pendant cet état cryptobiotique. Mon sujet de thèse s"inscrit dans le contexte de l"étude d"une de ces lésions subies par

l"ADN après irradiation provoquée par le rayonnement solaire et plus particulièrement le

rayonnement ultra-violet ainsi que sa réparation enzymatique. Ce travail a été effectué dans

deux laboratoires, le Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux, spécialisé dans l"étude

des métalloenzymes, et le laboratoire des Lésions des Acides Nucléiques, dont les

thématiques concernent la synthèse et l"analyse de lésions de l"ADN. C"est cette

complémentarité qui a permis de mener à bien le projet. Après un rappel sur les spores de

bactéries et sur les lésions de l"ADN en général, nous présenterons la lésion UV-induite

spécifique des spores. Nous verrons que cette lésion est réparée spécifiquement par une

métalloprotéine (la Spore Photoproduct Lyase ou SPL) appartenant à la superfamille des

" Radical-SAM » qui sera présentée à la fin de cette introduction.

Introduction

24

I. Les spores de bactéries

C"est à la fin du XIXème siècle, en 1876, que Cohn et Koch découvrent de façon

indépendante les spores de bactéries, bien qu"en 1838 ait été déjà rapportée la présence de

corps réfractiles dans certaines cellules bactériennes. Alors que Cohn se concentrait sur une recherche plus fondamentale concernant la compréhension de la résistance à la chaleur de

certaines bactéries, l"intérêt de Koch était plus appliqué, recherchant comment combattre les

maladies de l"époque et particulièrement la maladie du charbon

1. C"est Koch, qui, 12 ans plus

tard, décrivit en premier le cycle complet sporulation - germination - multiplication -

resporulation (Schéma 1).quotesdbs_dbs6.pdfusesText_12

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