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UNIVERSITE PARIS 7 - DENISDIDEROT

UFR deBiochimie

Année 2003

THESE pourl'obtentionduDiplôme de

DOCTEURDE L'UNIVERSITE PARIS7

Spécialité:Microbiologie fondamentale

présentéeetsoutenue publiquementpar

Anne DUMAY

CONTROLE DE LARECOMBINAISONHOMOLOGUE PAR

L'ONCOPROTEINE ANTI-APOPTOTIQUE BCL-2.

Soutenuele 03/12/03

devantle jurycomposéde:

Pr. Jean-Marie DUPRET

Président

Dr. Martine DEFAIS

Rapporteur

Pr. Bernard MIGNOTTE

Rapporteur

Dr. Filippo ROSSELLI

Examinateur

Dr. Bernard LOPEZ

Directeurdethèse

c,o,,0 l71-

REMERCIEMENTS

J'adresse tous mes remerciements à Jean-Marie Dupret, Martine Defais, Bernard Mignotte, etFilippoRosselli qui ont accepté d'être juges de cette thèse. Je tiens à exprimer toute ma gratitude à EDF et au CEA qui m'ont financé ces années de thèse, et sans qui je n'aurais pu m'investir dans le monde de la recherche. Je remercie Bernard Lopez de m'avoir accueillie dans son laboratoire et proposée un sujet de recherche aussi intéressant. Merci pour avoir su me guider, pour ton enthousiasme et ta disponibilité. Merci à tous les membres présents et passés de l'équipe LMR. Bernard, merci aussi pour tes discussions: de Bid aux OGM, en passant par Schubert. Merci à... Fabien (pour ton amitié, ton soutien et tes Moritos, promis: j'arrête les paris), Fayza (pour tes encouragements et ta recette du grog, et tiens bon: c'est à toi de jouer maintenant), David (pour ton point de vue sur la chasse que je déplore moins désormais), Patrick (non, je garderais mes filtres roses, merci quand même pour ta vision du monde), Olive (pour les deux premières années passées dans le labo, bonne chance dans la protéomique), Pascale (merci pour tes conseils et ton sens critique), Yannick (pour avoir consacré du temps à la correction de ce manuscrit, et les brioches que tu sais si bien faire), Sylvie (bien loin déjà), Jasée (le NHEJ n'aura bientôt plus de secret pour toi), Isa (pour ta bonne humeur qui avec Julia ne devrait pas s'altérer), François (pour ta disponibilité dans mes déboires avec l'informatique, au fait, à quand la prochaine escale en Thaïlande?), Fabienne (dernière arrivée au labo, bon courage avec la GFP)... Ca m'a fait plaisir de partager ces quelques années avec vous, malgré les hauts et les bas indissociables d'une vie en communauté dans quelques mètres carrés. Oups, j'oubliais Morissette, qui du haut de son placard garde un oeil rieur sur nous, merci quand même... Merci aussi aux non-membres du LMR, notamment Anne (pour les pauses chocolat au troisième, Paris-Bordeaux-Marcoule... et après?), Fabrice (la vie est belle), Marie (tu reviens quand?), Laurence (bonne chance pour la suite)... Et surtout, un grand grand merci à ma famille. Il m'est impossible de vous témoigner toute ma reconnaissance en si peu de lignes. De Vélizy à Toulouse en passant par Bordeaux, la Châtre, Meylan, Meyzieu, Paris... sachez que j'ai apprécié votre soutien et cette confiance que vous me témoignez. Papa, Maman, d'être toujours présent en cas de cafard ou de doute, il va falloir songer à me présenter Moana Ill (depuis l'temps...). Hélène, en tant que grande soeur tu m'as bien montré le chemin à suivre, merci pour tous tes encouragements; au fait, on le tient quand ce fameux pari? Sèv, Toulouse est une ville que j'apprécie beaucoup maintenant; méfie toi des bretzelles géants.

Merci à tous.

INTRODUCTION11

AVANT-PROPOS12

STRESS GENOTOXIQUE ET REPARATION DEL'ADN14

A. STRESS GÉNOTOXIQUES14

1.Stressendogènes14

I.1.Réplication de l'ADN14

I.2.Stress oxydatif14

I.3.Autres stress endogènes15

11.Stress exogènes15

11.1. Irradiations15

II.1.a. Les radiations non ionisantes, cas des UV16 II.1.b. Les radiations ionisantes, cas des rayons gamma17

II.2. Agents chimiques18

III.Conclusion18

B. MÉCANISMES DE RÉPARATION DE L'ADN19

1.Mécanismes de réparation par excision / resynthèse19

I.1.Réparation par excision de base (BER)19

I.2.Réparation par excision de nucléotide (NER)21 I.3.Mécanisme de réparation des mésappariements(MMR)23 II.Mécanismes de réparation des cassures simple brin25

II.1.Réparation par excision de base (BER)26

II.2.Réparation par recombinaison homologue (HR), modèle de Radding26

II.3.Synthèse d'ADN translésionnelle(TLS)29

M.Mécanismes de réparation des cassures double brin30 III.1. Réparation par ligature des extrémités d'ADN (NHEJ)31 III.2. Réparation par recombinaison homologue(HR)33

III.2.a. Groupe d'épistasie de Rad5234

III.2.b. Réparation par dégradation / hybridation d'ADN(SSA)41 III.2.c. Réparation par conversion génique (GC), modèle de Szostak42 III.2.d. Réparation par synthèse d'ADN dépendante d'hybridation (SDSA)45 II1.3.e. Réparation par réplication induite par une cassure (BIR)46

IV.Conclusion47

REPONSE CELLULAIRE À UNE CASSURE D'ADN DOUBLE BRIN49 A.VOIE DE SIGNALISATION DES CASSURES DOUBLE BRIN50

I.Présentation de la protéine Atm50

Il.Transduction de signal par Atm

11.1. Contrôle du cycle cellulaire53

II.1.a. arrêt en phase G154

Il.1.b. ralentissement de la phaseS55

11.1.c.blocage en phase G2/M55

1I.2.Réparation de l'ADN56

II.2.a. modification chromatinienne56

II.2.b. action sur les mécanismes de réparation56

11.3. Apoptose60

B.CHOIX DE LA REPONSE CELLULAIRE FACE À L'ENDOMMAGEMENT DE L'ADN60 I.Choix de vie ou de mort de la cellule: cas de P5361

I.1.Contexte cellulaire61

I.2.Intensité du stress génotoxique61

I.3.Efficacité de réparation des dommages de l'ADN62

I.4.Niveau d'expression de P5362

I.S. Différence d'affinité de P5363

IIChoix de réparer les cassures double brin par le NHEJ ou laHR63

II.1. influence de l'organisme63

11.1.a. la levure64

11.1.b.les mammiferes64

11.2. Compétition NHEJ/HR chez les mammiferes65

II.2.a. hypothèse d'une compétition Ku/Rad5265 II.2.b. hypothèse d'une action séquentielle du NHEJ et de laHR67

II.3. Conclusion68

III. Conclusion69

APOPTOSE70

A.LA MORT CELLULAIRE70

1.La nécrose70

1. L apoptose71

z

111. La mort mitotique72

B.L'APOPTOSE73

1. L'apoptose chez Caenorhabditis elegans74

11. L'apoptose chez les mammifères77

I1.1.Les caspases77

IL1.a. caspases et procaspases77

IL1.b.activation et action des caspases79

11.2. Voie mitochondriale81.................................................................................

I1.3.Voie des récepteurs de mort83

I1.4.Voie apoptotique indépendante des caspases85

C.FAMILLE DE PROTÉINES BCL-286

1.Classification des membres de la famille de Bcl-288

I.1. Sous famille anti-apoptotique, cas de Bd-290

I.2 Les protéines pro-apoptotiques à plusieurs domaines BH: cas deBax91

1.3. Sous famille pro-apoptotique, à domaine BH3 unique92

I.3.a. Les protéines de typeBid,93

1.3.bLes protéines de type Bad94

I.4 Conclusion95

11.Les domaines conservés97

I1.1BH1, BH2 et BH3: domaines d'interaction protéique97

11.2. BH3: domaine pro-apoptotique99

I1.3.BH4: domaine régulateur100

I1.4.TM: domaine transmembranaire101

II.5. Conclusion103

III.Autres fonctions des membres de la famille de Bcl-2104 I11.1.Inhibition de la translocation deP53au noyau par Bd-2104

I11.2.Cycle cellulaire105

111.3. Réparation106

IV.Conclusion et présentation du sujet de recherche109

RESULTATS111

A. STRATÉGIE DE MESURE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE112

1.Lignée pJS 3.10112

1.1. Substrat de recombinaiosn des pJS 3.10112

3

I.2. Estimation de larecombinaison homologue113

H.LignéeCHO-DRA10114

II.1.Substratderecombinaisondes CHO-DRA10114

II.2.Estimation de larecombinaison homologue114

II.2.a Expression de l'endonucléase I-Scel114

II.2.b.Irradiations118

B.RÉSULTATS PRÉCÉDEMMENT OBTENUSAULABORATOIRE1 18

1.Problématique118

H.Bcl-2affectelarecombinaison homologue118

III. Bcl-2inhibela conversiongénique119......................

C.LIGNÉES CELLULAIRES120

D.ETUDE DU MODED'ACTIONDE BCL-2SURLARECOMBINAISON HOMOLOGUE122

1.Hypothèse d'unsignal extracellulaire122

H.Etuded'unmutantG145ABcl-2déficientpour soncaractèreanti-apoptotique126 II.1. Expression deY28ABcl-2 et deG145ABc1-2danslalignéeCHO-DRA 10126

II.1.a. Localisation des formesmutantesdeBd-2127

II.1.b.Caractèreapoptotique des formesmutantesdeBd-2128

11.2.Etude de larecombinaisonhomologuedansdescellules qui exprimentY28ABci-2ouG145ABcl-2131

11.3. Conclusion133

III.Effetde Bcl=2surlaprotéineRad5l134

III.1 Analyse quantitative de Rad5l135

I11.2. Etude de la relocalisation de Rad5laprès uneirradiationgamma135

III.3. Analyse qualitative de Rad5l137

I11.4.Conclusion141

E.EFFETSDESMEMBRESPRO-APOPTOTIQUES BAX ET BIDSURLARECOMBINAISONHOMOLOGUE141

1.Etuded'unesurexpression de Bax142

I.1.Effetde HA-Baxsurlarecombinaison homologue142

I.2.Effetde HA-BaxzTMsurlarecombinaison homologue143

11.Etuded'unesurexpression de Bid145

II.1.Mesurede larecombinaison induiteparuneirradiationgamma145 II.2.Réparation d'une cassuredoublebrinuniqueinduitepar I-Scel146

111.Conclusion147

F. IMPLICATION DUDOMAINEBH3DANS L'INHIBITIONDE LARECOMBINAISON HOMOLOGUE148 4

1. Effet de Bc12ABH3 sur la recombinaison homologue induite aux rayons gamma150

II.Effet de Bcl2ABH3 sur la recombinaison homologue induite par une irradiation UV-C151

III.Conclusion152

DISCUSSION ET PERSPECTIVES153

A. SUREXPRIMER BCL-2: SURVIVRE MAIS MUTER154

1.Effet de Bcl-2 sur l'apoptose154

II. Effet deBcl-2sur la réparation de l'ADN155

II.1.Effet de Bd-2 sur les mécanismes fidèles de réparation155 II.2.Effet de Bd-2 sur les mécanismes infidèles de réparation

11.3. Conclusion157

B.ETUDEDU MODE D'ACTION DE BCL-2 SUR LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE158

1.Indépendance des différents caractères de Bcl-2158

II. Effet deBcl-2sur Rad51158

C. LE CARACTÈRE INHIBITEUR DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE SEMBLE GENERALISABLE AUX MEMBRES DE

LA FAMILLE DE BCL-2160

1.Bcl-2 et Bcl-xl160

H. Bcl-2, Bcl-xl, Bax et Bid inhibent la recombinaison homologue162

H. DomainesBH164

D. PROPOSITIONS DE MÉCANISMESD'ACTION DEBCL-2165

1.Bcl-2 etP53165

H.Bcl-2et Akt166

CONCLUSION168

MATERIEL ET METHODES170

A. SOUCHES, PLASMIDES ET MILIEUX UTILISÉS171

1.souches utilisées171

I.1.Souches bactériennesEscherichia coli171

I.2.Lignées cellulaires171

I1.Vecteurs d'expression172

II.1.Vecteurs disponibles172

II.2.Vecteurs construits173

5

III Composition des milieux deculture173

III.1. MilieuLB173

I11.2. Milieu DMEM174

B. TECHNIQUES DEBASES174

1.Clonage174

I.1.Transformation debactéries compétentes174

I.2.Préparation d'ADN plasmidique1175

1.3.Electrophorèse d'ADN175

11.Immunodétection deprotéines après électrophorèse(Western Blot)176

II.1.Extractionprotéique176

II.2.Electrophorèse deprotéinesen SDS-PAGE176

II.2.a. Electrophorèseclassique176

II.2.b. Electrophorèsebidimensionnelle177

II.3.Transfert surmembrane et immunodétection177

C. TECHNIQUES DE CULTURECELLULAIRE178

1.Transfections178

I.1.Cotransfection auchloruredecalcium179

I.2.Transfection au transfast179

II.Mesurede larecombinaisonhomologueinduite179

II.1.traitementgénotoxique179

II.1.a. Expositionauxradiationsionisantes179

II.1.b. Expositionaux UV179

II.1.c. Expression del'enzymede restriction I-Scel180

II.2.Technique demesurede larecombinaison180

111.Marquagepar immunofluorescence181

III.1.Révélationde l'épitope HA181

I11.2.MarquagedeBd-2181

I11.3.Révélationdes foci RadS 1182

I11.3. Montage et observation deslames182

BIBLIOGRAPHIE184

ARTICLES204

6

LISTEDES ABREVIATIONS

ADN:acide désoxyribonucléique

ADNc:ADN codant

AP: site apuriqueouapyrimidique

Apaf-1:facteur d'activationdes caspases(Apoptotic Protease Activating factor-1)

AT: syndromed'AtaxieTélangiectasie

ATLD:maladiede type AT(Ataxia Telangiectasia Like Disorder) Atm:protéine mutée associéeau syndrome AT(Ataxia Telangiectasia Mutated)

ATP:adénosine triphosphate

Atr: homologuemammifèrede Rad3(Ataxia Telangiectasia Rad3 related) Bad:protéinepro-apoptotique de lafamillede Bcl-2(Bcl-2 Antagonist of cell Death)quotesdbs_dbs43.pdfusesText_43

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