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C'est une « recombinaison homologue » Le plasmide F code des protéines qui Parfois l'ADN du plasmide s'intègre dans le chromosome bactérien à
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En effet les séquences de plasmide F ont des séquences homologues sur le chromosome L'insertion se fait par recombinaison site spécifique Page 5 Figure :
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homologue du récepteur et la remplace • C'est une « recombinaison homologue » Parfois l'ADN du plasmide s'intègre dans le chromosome bactérien à
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UNIVERSITE PARIS 7 - DENISDIDEROT
UFR deBiochimie
Année 2003
THESE pourl'obtentionduDiplôme deDOCTEURDE L'UNIVERSITE PARIS7
Spécialité:Microbiologie fondamentale
présentéeetsoutenue publiquementparAnne DUMAY
CONTROLE DE LARECOMBINAISONHOMOLOGUE PAR
L'ONCOPROTEINE ANTI-APOPTOTIQUE BCL-2.
Soutenuele 03/12/03
devantle jurycomposéde:Pr. Jean-Marie DUPRET
Président
Dr. Martine DEFAIS
Rapporteur
Pr. Bernard MIGNOTTE
Rapporteur
Dr. Filippo ROSSELLI
Examinateur
Dr. Bernard LOPEZ
Directeurdethèse
c,o,,0 l71-REMERCIEMENTS
J'adresse tous mes remerciements à Jean-Marie Dupret, Martine Defais, Bernard Mignotte, etFilippoRosselli qui ont accepté d'être juges de cette thèse. Je tiens à exprimer toute ma gratitude à EDF et au CEA qui m'ont financé ces années de thèse, et sans qui je n'aurais pu m'investir dans le monde de la recherche. Je remercie Bernard Lopez de m'avoir accueillie dans son laboratoire et proposée un sujet de recherche aussi intéressant. Merci pour avoir su me guider, pour ton enthousiasme et ta disponibilité. Merci à tous les membres présents et passés de l'équipe LMR. Bernard, merci aussi pour tes discussions: de Bid aux OGM, en passant par Schubert. Merci à... Fabien (pour ton amitié, ton soutien et tes Moritos, promis: j'arrête les paris), Fayza (pour tes encouragements et ta recette du grog, et tiens bon: c'est à toi de jouer maintenant), David (pour ton point de vue sur la chasse que je déplore moins désormais), Patrick (non, je garderais mes filtres roses, merci quand même pour ta vision du monde), Olive (pour les deux premières années passées dans le labo, bonne chance dans la protéomique), Pascale (merci pour tes conseils et ton sens critique), Yannick (pour avoir consacré du temps à la correction de ce manuscrit, et les brioches que tu sais si bien faire), Sylvie (bien loin déjà), Jasée (le NHEJ n'aura bientôt plus de secret pour toi), Isa (pour ta bonne humeur qui avec Julia ne devrait pas s'altérer), François (pour ta disponibilité dans mes déboires avec l'informatique, au fait, à quand la prochaine escale en Thaïlande?), Fabienne (dernière arrivée au labo, bon courage avec la GFP)... Ca m'a fait plaisir de partager ces quelques années avec vous, malgré les hauts et les bas indissociables d'une vie en communauté dans quelques mètres carrés. Oups, j'oubliais Morissette, qui du haut de son placard garde un oeil rieur sur nous, merci quand même... Merci aussi aux non-membres du LMR, notamment Anne (pour les pauses chocolat au troisième, Paris-Bordeaux-Marcoule... et après?), Fabrice (la vie est belle), Marie (tu reviens quand?), Laurence (bonne chance pour la suite)... Et surtout, un grand grand merci à ma famille. Il m'est impossible de vous témoigner toute ma reconnaissance en si peu de lignes. De Vélizy à Toulouse en passant par Bordeaux, la Châtre, Meylan, Meyzieu, Paris... sachez que j'ai apprécié votre soutien et cette confiance que vous me témoignez. Papa, Maman, d'être toujours présent en cas de cafard ou de doute, il va falloir songer à me présenter Moana Ill (depuis l'temps...). Hélène, en tant que grande soeur tu m'as bien montré le chemin à suivre, merci pour tous tes encouragements; au fait, on le tient quand ce fameux pari? Sèv, Toulouse est une ville que j'apprécie beaucoup maintenant; méfie toi des bretzelles géants.Merci à tous.
INTRODUCTION11
AVANT-PROPOS12
STRESS GENOTOXIQUE ET REPARATION DEL'ADN14
A. STRESS GÉNOTOXIQUES14
1.Stressendogènes14
I.1.Réplication de l'ADN14
I.2.Stress oxydatif14
I.3.Autres stress endogènes15
11.Stress exogènes15
11.1. Irradiations15
II.1.a. Les radiations non ionisantes, cas des UV16 II.1.b. Les radiations ionisantes, cas des rayons gamma17II.2. Agents chimiques18
III.Conclusion18
B. MÉCANISMES DE RÉPARATION DE L'ADN19
1.Mécanismes de réparation par excision / resynthèse19
I.1.Réparation par excision de base (BER)19
I.2.Réparation par excision de nucléotide (NER)21 I.3.Mécanisme de réparation des mésappariements(MMR)23 II.Mécanismes de réparation des cassures simple brin25II.1.Réparation par excision de base (BER)26
II.2.Réparation par recombinaison homologue (HR), modèle de Radding26II.3.Synthèse d'ADN translésionnelle(TLS)29
M.Mécanismes de réparation des cassures double brin30 III.1. Réparation par ligature des extrémités d'ADN (NHEJ)31 III.2. Réparation par recombinaison homologue(HR)33III.2.a. Groupe d'épistasie de Rad5234
III.2.b. Réparation par dégradation / hybridation d'ADN(SSA)41 III.2.c. Réparation par conversion génique (GC), modèle de Szostak42 III.2.d. Réparation par synthèse d'ADN dépendante d'hybridation (SDSA)45 II1.3.e. Réparation par réplication induite par une cassure (BIR)46IV.Conclusion47
REPONSE CELLULAIRE À UNE CASSURE D'ADN DOUBLE BRIN49 A.VOIE DE SIGNALISATION DES CASSURES DOUBLE BRIN50I.Présentation de la protéine Atm50
Il.Transduction de signal par Atm
11.1. Contrôle du cycle cellulaire53
II.1.a. arrêt en phase G154
Il.1.b. ralentissement de la phaseS55
11.1.c.blocage en phase G2/M55
1I.2.Réparation de l'ADN56
II.2.a. modification chromatinienne56
II.2.b. action sur les mécanismes de réparation5611.3. Apoptose60
B.CHOIX DE LA REPONSE CELLULAIRE FACE À L'ENDOMMAGEMENT DE L'ADN60 I.Choix de vie ou de mort de la cellule: cas de P5361I.1.Contexte cellulaire61
I.2.Intensité du stress génotoxique61
I.3.Efficacité de réparation des dommages de l'ADN62I.4.Niveau d'expression de P5362
I.S. Différence d'affinité de P5363
IIChoix de réparer les cassures double brin par le NHEJ ou laHR63II.1. influence de l'organisme63
11.1.a. la levure64
11.1.b.les mammiferes64
11.2. Compétition NHEJ/HR chez les mammiferes65
II.2.a. hypothèse d'une compétition Ku/Rad5265 II.2.b. hypothèse d'une action séquentielle du NHEJ et de laHR67II.3. Conclusion68
III. Conclusion69
APOPTOSE70
A.LA MORT CELLULAIRE70
1.La nécrose70
1. L apoptose71
z111. La mort mitotique72
B.L'APOPTOSE73
1. L'apoptose chez Caenorhabditis elegans74
11. L'apoptose chez les mammifères77
I1.1.Les caspases77
IL1.a. caspases et procaspases77
IL1.b.activation et action des caspases79
11.2. Voie mitochondriale81.................................................................................
I1.3.Voie des récepteurs de mort83
I1.4.Voie apoptotique indépendante des caspases85C.FAMILLE DE PROTÉINES BCL-286
1.Classification des membres de la famille de Bcl-288
I.1. Sous famille anti-apoptotique, cas de Bd-290
I.2 Les protéines pro-apoptotiques à plusieurs domaines BH: cas deBax911.3. Sous famille pro-apoptotique, à domaine BH3 unique92
I.3.a. Les protéines de typeBid,93
1.3.bLes protéines de type Bad94
I.4 Conclusion95
11.Les domaines conservés97
I1.1BH1, BH2 et BH3: domaines d'interaction protéique9711.2. BH3: domaine pro-apoptotique99
I1.3.BH4: domaine régulateur100
I1.4.TM: domaine transmembranaire101
II.5. Conclusion103
III.Autres fonctions des membres de la famille de Bcl-2104 I11.1.Inhibition de la translocation deP53au noyau par Bd-2104I11.2.Cycle cellulaire105
111.3. Réparation106
IV.Conclusion et présentation du sujet de recherche109RESULTATS111
A. STRATÉGIE DE MESURE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE1121.Lignée pJS 3.10112
1.1. Substrat de recombinaiosn des pJS 3.10112
3I.2. Estimation de larecombinaison homologue113
H.LignéeCHO-DRA10114
II.1.Substratderecombinaisondes CHO-DRA10114
II.2.Estimation de larecombinaison homologue114
II.2.a Expression de l'endonucléase I-Scel114
II.2.b.Irradiations118
B.RÉSULTATS PRÉCÉDEMMENT OBTENUSAULABORATOIRE1 181.Problématique118
H.Bcl-2affectelarecombinaison homologue118
III. Bcl-2inhibela conversiongénique119......................C.LIGNÉES CELLULAIRES120
D.ETUDE DU MODED'ACTIONDE BCL-2SURLARECOMBINAISON HOMOLOGUE1221.Hypothèse d'unsignal extracellulaire122
H.Etuded'unmutantG145ABcl-2déficientpour soncaractèreanti-apoptotique126 II.1. Expression deY28ABcl-2 et deG145ABc1-2danslalignéeCHO-DRA 10126II.1.a. Localisation des formesmutantesdeBd-2127
II.1.b.Caractèreapoptotique des formesmutantesdeBd-212811.2.Etude de larecombinaisonhomologuedansdescellules qui exprimentY28ABci-2ouG145ABcl-2131
11.3. Conclusion133
III.Effetde Bcl=2surlaprotéineRad5l134
III.1 Analyse quantitative de Rad5l135
I11.2. Etude de la relocalisation de Rad5laprès uneirradiationgamma135III.3. Analyse qualitative de Rad5l137
I11.4.Conclusion141
E.EFFETSDESMEMBRESPRO-APOPTOTIQUES BAX ET BIDSURLARECOMBINAISONHOMOLOGUE1411.Etuded'unesurexpression de Bax142
I.1.Effetde HA-Baxsurlarecombinaison homologue142
I.2.Effetde HA-BaxzTMsurlarecombinaison homologue14311.Etuded'unesurexpression de Bid145
II.1.Mesurede larecombinaison induiteparuneirradiationgamma145 II.2.Réparation d'une cassuredoublebrinuniqueinduitepar I-Scel146111.Conclusion147
F. IMPLICATION DUDOMAINEBH3DANS L'INHIBITIONDE LARECOMBINAISON HOMOLOGUE148 41. Effet de Bc12ABH3 sur la recombinaison homologue induite aux rayons gamma150
II.Effet de Bcl2ABH3 sur la recombinaison homologue induite par une irradiation UV-C151III.Conclusion152
DISCUSSION ET PERSPECTIVES153
A. SUREXPRIMER BCL-2: SURVIVRE MAIS MUTER154
1.Effet de Bcl-2 sur l'apoptose154
II. Effet deBcl-2sur la réparation de l'ADN155
II.1.Effet de Bd-2 sur les mécanismes fidèles de réparation155 II.2.Effet de Bd-2 sur les mécanismes infidèles de réparation11.3. Conclusion157
B.ETUDEDU MODE D'ACTION DE BCL-2 SUR LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE1581.Indépendance des différents caractères de Bcl-2158
II. Effet deBcl-2sur Rad51158
C. LE CARACTÈRE INHIBITEUR DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE SEMBLE GENERALISABLE AUX MEMBRES DELA FAMILLE DE BCL-2160
1.Bcl-2 et Bcl-xl160
H. Bcl-2, Bcl-xl, Bax et Bid inhibent la recombinaison homologue162H. DomainesBH164
D. PROPOSITIONS DE MÉCANISMESD'ACTION DEBCL-21651.Bcl-2 etP53165
H.Bcl-2et Akt166
CONCLUSION168
MATERIEL ET METHODES170
A. SOUCHES, PLASMIDES ET MILIEUX UTILISÉS171
1.souches utilisées171
I.1.Souches bactériennesEscherichia coli171
I.2.Lignées cellulaires171
I1.Vecteurs d'expression172
II.1.Vecteurs disponibles172
II.2.Vecteurs construits173
5III Composition des milieux deculture173
III.1. MilieuLB173
I11.2. Milieu DMEM174
B. TECHNIQUES DEBASES174
1.Clonage174
I.1.Transformation debactéries compétentes174I.2.Préparation d'ADN plasmidique1175
1.3.Electrophorèse d'ADN175
11.Immunodétection deprotéines après électrophorèse(Western Blot)176
II.1.Extractionprotéique176
II.2.Electrophorèse deprotéinesen SDS-PAGE176II.2.a. Electrophorèseclassique176
II.2.b. Electrophorèsebidimensionnelle177
II.3.Transfert surmembrane et immunodétection177C. TECHNIQUES DE CULTURECELLULAIRE178
1.Transfections178
I.1.Cotransfection auchloruredecalcium179
I.2.Transfection au transfast179
II.Mesurede larecombinaisonhomologueinduite179
II.1.traitementgénotoxique179
II.1.a. Expositionauxradiationsionisantes179
II.1.b. Expositionaux UV179
II.1.c. Expression del'enzymede restriction I-Scel180II.2.Technique demesurede larecombinaison180
111.Marquagepar immunofluorescence181
III.1.Révélationde l'épitope HA181
I11.2.MarquagedeBd-2181
I11.3.Révélationdes foci RadS 1182
I11.3. Montage et observation deslames182
BIBLIOGRAPHIE184
ARTICLES204
6LISTEDES ABREVIATIONS
ADN:acide désoxyribonucléique
ADNc:ADN codant
AP: site apuriqueouapyrimidique
Apaf-1:facteur d'activationdes caspases(Apoptotic Protease Activating factor-1)AT: syndromed'AtaxieTélangiectasie
ATLD:maladiede type AT(Ataxia Telangiectasia Like Disorder) Atm:protéine mutée associéeau syndrome AT(Ataxia Telangiectasia Mutated)ATP:adénosine triphosphate
Atr: homologuemammifèrede Rad3(Ataxia Telangiectasia Rad3 related) Bad:protéinepro-apoptotique de lafamillede Bcl-2(Bcl-2 Antagonist of cell Death)quotesdbs_dbs43.pdfusesText_43[PDF] évaluation des risques environnementaux
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