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N° d'ordre:

253 - 2014 Année 2014

THÈSE DE L'UNIVERSITÉ DE LYON

UNIVERSITÉ CLAUDE BERNARD LYON 1

ÉCOLE

DOCTORALE E2M2

Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation Spécialité: Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

DIPLÔME DE DOCTORAT

(Arrêté du 7 août 2006)

Soutenue publiquement le 28 novembre 2014 par

Amélie Cairey-Remonnay

Caractérisation d'un rôle inédit de la glycolyse : contrôle du senseur du glucose et de la voie de la signalisation du glucose chez la levure Kluyveromyces lactis Jury: Rapporteurs : M. Michele BIANCHI, Professeur Sapienza Universita di Roma Mme. Anne DEVIN,Directeur de Recherche Université Bordeaux Segalen M. Sébastien LEON, Chargé de Recherche Université Paris Diderot Examinateurs : M. Christophe BRUEL, Professeur Université Lyon I Directeur de thèse : M. Marc LEMAIRE , Professeur Université Lyon I M. Alexandre SOULARD, Maître de Conférence Université Lyon I

Unité de rattachement : UMR5240 Microbiologie, Adaptation et Pathogénie - Université Lyon I -

Campus de la Doua

- Bâtiment Lwoff - 10 rue Dubois - 69622 Villeurbanne cedex 3

Président de l'Université

président du Conseil d'Administration - Claude Bernard - Charle

Faculté d'Odontologie

Observatoire des Sciences de l'Univers de Lyon

Ecole Supérieure du Professorat et de l'Education 4 5

Remerciements

Tout d'abord, je tiens à remercier les rapporteurs, Anne Devin, Michele Bianchi et Sébastien Leon,

qui ont accepté d'évaluer ce travail de doctorat. Merci également à Christophe Bruel qui a accepté de

faire partie du jury de cette thèse.

Merci à Marc qui m'a donné la chance de pouvoir réaliser cette thèse au sein de son équipe. Merci

de m'avoir fait confiance dès le départ. Merci aussi pour les conseils toujours avisés et les petites

astuces de laboratoire.

Un grand merci à Alexandre qui m'a encadrée tout au long de cette thèse. J'ai apprécié pendant ces

trois ans ta grande disponibilité, ta passion et ta curiosité scientifique ainsi que ton expertise en

Western blot ! Les nombreuses réunions que nous avons pu faire étaient toujours fructueuses et

motivantes. (et puis sur un plan moins professionnel, tu contribues toi aussi à la bonne ambiance au

2

ème

étage, c'est quand même toi qui a instauré le café croissant du jeudi !)

Je souhaiterais remercier tous les membres de l'équipe " levures » ; tout d'abord Julien D. pour l'aide

précieuse que tu m'as apportée à la paillasse, entre construction de souches et Western en séries.

Un grand merci à Claire pour tous les milieux que tu as pu me préparer et ta gentillesse au quotidien.

Merci également à Pascale, j'ai beaucoup apprécié échanger avec toi, que ce soit scientifique ou pas

du tout. Merci à Cécile, qui nous a rejoints il y a maintenant un peu plus d'un an, pour sa présence

agréable. Merci à Micheline, qui profite maintenant de sa retraite. Merci à Paul Chameroy que j'ai

encadré pour un stage de M1 et qui a fait avancer mon projet à la paillasse.

Merci à tous les membres du MAP qui ont pu m'aider de près ou de loin au cours de ces trois années

de thèse. Un merci particulier pour l'équipe de secrétaires et leur aide lors des démarches

administratives.

Je tiens à remercier Jean Marie François du LISBP à Toulouse pour la collaboration pour l'analyse

métabolomique. Merci de m'avoir accueilli dans votre laboratoire pendant 15 jours en octobre 2013.

Un grand merci également à Amélie Vax qui a terminé la préparation des échantillons et qui a réalisé

toute l'analyse de mes centaines d'échantillon en HPLC ainsi que le traitement des données. Merci à

Marjorie Petitjean et Marie-Ange Teste qui m'ont accueilli dans le laboratoire à Toulouse et m'ont

aidé dans mon installation les premiers jours.

Je souhaiterai également remercier les membres de mon comité de pilotage, Cécile Fairhead de

l'université Paris Sud, Gaël Yvert de l'ENS-Lyon et Jean Marie François de l'INSA de Toulouse qui ont

accepté de suivre l'évolution de cette thèse et m'ont donné des conseils pertinents pour son bon

déroulement. Merci également à Karen Moreau, ma tutrice de l'école doctorale, qui a assisté aux

comités de pilotage et a suivi le déroulement de cette thèse.

Je souhaiterais remercier toutes les personnes que j'ai côtoyées au cours de ces trois années :

Tout d'abord, un grand merci aux nombreux occupants du bureau qui sont restés ou se sont

succédés, et ont contribué à la bonne ambiance qui y règne. Je commence par ceux qui sont partis

vers d'autres horizons : Sana, c'était vraiment très agréable de travailler avec toi, mais aussi de

partager de bons moments en dehors du labo. Je te souhaite tout le meilleur pour la suite. Géraldine,

j'ai beaucoup apprécié discuter avec toi. L'horizon du 4

ème

étage n'est pas si loin, j'espère te revoir

avant mon départ du laboratoire et je te souhaite également le meilleur pour la suite. J'ai également

beaucoup apprécié travaillé avec Daniela et Elsa, même si elles n'ont pas été présentes très

longtemps. Pour ceux qui sont encore là, il y a Kévin et Julien C., alias Bobby et Billy, ou Billy et

6 Bobby, je m'y perds un peu ! Vous avez largement contribué à la bonne ambiance dans ce bureau.

Kévin, tu commences quand je finis, bon courage pour les 3 années qui t'attendent. Julien, j'espère

que tu trouveras rapidement un poste au moins aussi bien ! Et puis il y a Manon, qui était là quand je

suis arrivée et qui sera encore un peu là quand je partirai (dit comme ça, on dirait presque un vieux

meuble...) Heureusement que tu étais là pour partager toutes les étapes d'une thèse avec moi, et

surtout pendant les mois de rédaction. Ta soutenance suit la mienne, je suis sûre que tu t'en sortiras

très bien. J'espère aussi que tu trouveras un post-doc dans la montagne de tes rêves !

Merci à tous les occupants du 2

ème

étage que j'ai apprécié de côtoyer tous les jours, pour une pause

croissant du jeudi ou un repas du midi, et notamment à tous les membres de l'équipe bactéries et

métaux : Marie-Andrée, Agnès et Erwan en plus de ceux qui ont partagé mon bureau. Merci aux MAPiens pour les discussions de couloir : Magali, Camille P., Elodie, Natasha, Camille V.,

Benjamin, Florence, et j'en oublie certainement.

En dehors du labo, je souhaite d'abord remercier ma famille. D'abord mes parents, qui m'ont donné

le goût du travail et m'ont soutenu au long de ces 3 années. Ensuite, mes frères, Augustin, Emmanuel

et Antoine. Promis, maintenant j'arrête de bosser quand je viens à la maison. Merci également à mes

grands-parents, mes oncles et mes tantes, mes cousins qui m'ont toujours entouré.

Merci à la famille de Thomas, qui m'a toujours très bien accueilli. J'ai beaucoup apprécié les journées

de marche en montagne suivies par des repas à parler de recherche avec vous. Merci à mes amis, qui m'ont soutenu et changé les idées pendant ces années.

Lucile, un jour on devrait compter le nombre de mots (toujours très recherchés !) échangés par chat

ou mail depuis qu'on sait se servir d'internet... Toi aussi t'as jugé que faire une thèse était une

excellente idée, je te souhaite bien du courage pour la terminer ! Et puis maintenant j'aurai peut-être

un peu plus de temps pour venir voir les aurores boréales chez toi !

Merci à la meute, Anaïs, Aurore, Caro, Claire, Clara, Héloïse, Manue et Morgane. Vivement le

prochain week-end avec vous ! Bon, je nous souhaite de nombreux gâteaux au chocolat pour les

années à venir, des virées à droite à gauche (à l'autre bout du monde, qui sait ?), et peut-être même

des petits louvetaux.

Merci aux G-stars, même si on s'est trop peu vu pendant ces trois ans (heureusement qu'il y avait le

mariage de Julie !) J'espère bien qu'on va se rattraper par la suite ! Bon courage à Clémence et Seb

qui finissent leur thèse, et bonne chance pour la suite aux autres. Enfin, merci à Thomas pour son soutien pendant ces années. C'est trop gentil à toi d'avoir

absolument tenu à m'attendre pour finir à ton tour ;) Et vivement l'après-thèse, et de nouveaux

projets tous les deux. 7

Résumé

Chez les levures, organismes eucaryotes unicellulaires, le glucose est la source d'énergie préférée. La levure modèle Kluyveromyces lactis possède deux perméases au glucose. L'expression d'une de ces deux perméases, codée par le gène RAG1, est induite par la présence de glucose extracellulaire et cette régulation transcriptionnelle dépend de la détection du glucose par un senseur membranaire spécifique, Rag4. Cependant, la régulation de l'expression de RAG1 dépend également de la capacité des cellules à métaboliser le glucose via la glycolyse. En effet, l'expression de RAG1 est fortement affectée dans des mutants glycolytiques malgré la présence de glucose extracellulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à déterminer les mécanismes via lesquels la glycolyse contrôle l'expression de RAG1. Grâce à l'utilisation de mutants glycolytiques ou d'inhibiteurs chimiques de la glycolyse chez

K. lactis, nous avons démontré que la glycolyse régule la stabilité du senseur Rag4 à la

membrane plasmique et contrôle ainsi la voie de signalisation du glucose et l'expression de RAG1. De plus, ce mécanisme de contrôle est conservé chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. L'étude plus approfondie de Rag4 nous a permis de déterminer que la transmission du signal glucose requiert la queue C-terminale cytoplasmique de Rag4, qui sert de plateforme d'interaction protéique. La caractérisation fonctionnelle de Rag4 nous a permis de mettre en évidence que la protéine contient plusieurs domaines impliqués dans le contrôle de sa stabilité en fonction du type de signal induisant la déstabilisation: signal glycolytique ou changement de source de carbone. Enfin, la nature du signal issu de la glycolyse qui cible le senseur membranaire Rag4 a été étudiée en testant deux hypothèses : le signal est protéique (enzyme de la glycolyse) ou métabolique (métabolite intermédiaire de la glycolyse).

Ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle inédit de la glycolyse dans le

contrôle de la stabilité des senseurs membranaires du glucose chez les levures K. lactis et S. cerevisiae.

Mots-clés :

glucose, glycolyse, levure, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, senseur du glucose, signalisation du glucose 8

Summary

Yeasts are unicellular eukaryotic organisms which prefer glucose as energy source. The yeast model Kluyveromyces lactis has two glucose permeases. The expression of one of its permeases, RAG1, is induced by extracellular glucose. The glucose signaling pathway responsible for RAG1 expression regulation is dependent upon glucose sensing through a specific membrane glucose sensor, Rag4. However, RAG1 expression is also dependent upon glucose metabolism by glycolysis. Indeed, in glycolytic mutants RAG1 expression is strongly affected even when glucose is present. During these doctoral studies, we characterized mechanisms involved in glycolytic control on glucose signaling. Using glycolytic mutant or glycolysis chemical inhibitors, we have demonstrated that, in K. lactis, glycolysis targets the stability of the glucose sensor Rag4, controlling glucose signaling and RAG1 expression. This glycolytic control appears to be conserved in the yeast model

Saccharomyces cerevisiae.

We have shown that the C-terminal cytoplasmic tail of glucose sensor Rag4 is necessary for glucose signaling and forms a protein interaction platform. Rag4 protein contains several domains controlling Rag4 stability in response to different destabilization signals: glycolytic signal or carbon source signal. Finally, the nature of the glycolytic signal was studied considering two hypotheses: protein nature (e.g. glycolytic enzyme) or metabolic nature (e.g. glycolysis metabolic intermediate). This doctoral thesis underlines a new role of glycolysis in controlling membrane glucose sensor stability in K. lactis and S. cerevisiae.

Keywords:

glucose, glycolysis, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, glucose sensor, glucose signaling 9

Abbréviations

2DG 2-déoxyglucose

3BrPA 3-bromopyruvate

ADN acide désoxyribonucléique

ADP adénosine diphosphate

AMP adénosine monophosphate

AMPc adénosine monophosphate cyclique

ATP adénosine triphosphate

DMSO diméthylsulfoxide

DO densité optique

DTT dithiothréitol

EDTA acide éthylène diamine tétraacétique GAPDH glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase HPLC chromatographie à haute performance en phase liquide

IA iodoacétate

IP immunoprécipitation

IPTG isopropyl ɴ-D-1-thiogalactopyranoside

KCl chlorure de potassium

MOPS acide 3-(N-morpholino) propane sulfonique

NaCl chlorure de sodium

NAD nicotinamide adénine dinucléotide

NADP nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

NaF fluorure de sodium

NP-40 nonyl phénoxypolyéthoxyléthanol

PCR réaction de polymérase en chaîne

PMSF fluorure de phénylméthylsulfonyle

qRT-PCR réaction quantitative de polymérase en chaîne après transcription réverse SDS dodécylsulfate de sodium = laurylsulfate de sodium

SG milieu minimum synthétique glucose

SGal milieu minimum synthétique galactose

Sgly milieu minimum synthétique glycérol

Slactate milieu minimum synthétique lactate

TCA acide trichloroacétique

TEMED tétraméthyléthylènediamine

UV rayonnement ultra-violet

v/v pourcentage volume/volume w/v pourcentage poids/volume

WB Western blot

YPG milieu riche glucose

YPGal milieu riche galactose

YPgly milieu riche glycérol

YPlactate milieu riche lactate

10

Sommaire

I. Contexte bibliographique .............................................................................. 13

1. Le glucose, source d'énergie favorite des organismes vivants ..................................... 15

2. Le transport du glucose................................................................................................. 17

2. a. Les différents types de transporteurs du glucose ................................................. 17

2. b. Deux modèles levures pour l'étude de la régulation du transport du glucose :

Kluyveromyces lactis et Saccharomyces cerevisiae ....................................................... 19

2. c. Les perméases au glucose chez les levures ........................................................... 23

2. d. La régulation transcriptionnelle des gènes des perméases au glucose de faible

affinité ........................................................................................................................... 25

2. e. La régulation de la stabilité membranaire des perméases au glucose ................. 35

3. Les voies de signalisation du glucose et de contrôle de l'expression des gènes des

perméases au glucose chez les levures............................................................................. 38

3. a. La voie de signalisation du glucose dépendante des senseurs Rgt2/Snf3/Rag4 .. 38

3. b. Les autres voies de signalisation du glucose ......................................................... 49

3. c. Les autres voies de signalisation qui affectent l'expression des perméases au

glucose chez les levures ................................................................................................ 57

4. La glycolyse chez les levures ......................................................................................... 59

4. a. Le métabolisme du glucose par la glycolyse et sa régulation chez les levures ..... 59

4. b. Quelques différences concernant le métabolisme du glucose chez S. cerevisiae et

K. lactis .......................................................................................................................... 62

4. c. Le contrôle de la glycolyse chez les levures .......................................................... 64

4. d. Les inhibiteurs chimiques de la glycolyse chez les levures ................................... 71

4. e. La glycolyse comme régulateur de voies de signalisation..................................... 75

4. f. Contrôle de la signalisation du glucose par la glycolyse chez les levures .............. 79

II. Objectifs des travaux de thèse ..................................................................... 81

III. Résultats ...................................................................................................... 85

Chapitre 1 : Analyse fonctionnelle des mécanismes de régulation de la voie de

signalisation du glucose par la glycolyse chez les levures ......................................... 87

1. Introduction et résumé de la publication ..................................................................... 87

2. Publication Cairey-Remonnay et al., 2014 .................................................................... 89

3. Résultats complémentaires ........................................................................................ 112

11

3. a. Etude de la signalisation du glucose dans des mutants glycolytiques chez K. lactis

..................................................................................................................................... 112

3. b. Utilisation d'inhibiteurs chimiques de la glycolyse chez K. lactis ....................... 121

3. c. Contrôle de la signalisation du glucose par la glycolyse chez S. cerevisiae ......... 131

4. Contrôle de la glycolyse sur la signalisation et les senseurs du glucose chez les levures

K. lactis et S. cerevisiae : discussion, conclusions et perspectives ................................. 137

Chapitre 2 : Etude du senseur du glucose Rag4 chez K. lactis : la queue cytoplasmique C-terminale est impliquée à la fois dans la signalisation du glucose et

le contrôle de la stabilité de la protéine ................................................................. 141

1. Etude de la séquence de Rag4 : prédiction bioinformatique des domaines

transmembranaires et cytoplasmiques .......................................................................... 142

2. Rôle et fonctionnement de la queue C-terminale du senseur du glucose Rag4 dans la

signalisation du glucose .................................................................................................. 143

2. a. Importance de la queue C-terminale cytoplasmique du senseur du glucose Rag4

dans la signalisation du glucose .................................................................................. 144

2. b. Interaction physique et fonctionnelle de la queue C-terminale du senseur du

glucose Rag4 avec la caséine kinase de type I Rag8 ................................................... 148

2. c. Rôle de la queue C-terminale cytoplasmique du senseur du glucose Rag4 dans la

signalisation du glucose - Conclusions ........................................................................ 151

3. Contrôle de la stabilité du senseur du glucose Rag4 : conditions, domaines requis et

mécanismes mis en jeu ................................................................................................... 152

3. a. Stabilité du senseur du glucose en fonction de la source de carbone ................ 153

3. b. Stabilité de mutants de la queue C-terminale .................................................... 156

3. c. Mécanismes et domaines protéiques impliqués dans la déstabilisation de Rag4

..................................................................................................................................... 158

3. d. Conditions et domaines impliqués dans la régulation de la stabilité de Rag4 -

Conclusions .................................................................................................................. 168

4. Stabilité, dégradation et fonctionnalité du senseur du glucose Rag4. Conclusions,

discussions et perspectives ............................................................................................. 169

Chapitre 3 : Nature du signal glycolytique qui contrôle la voie de signalisation du

glucose ..................................................................................................................... 177

1. Hypothèse protéique du signal issu de la glycolyse et contrôlant la signalisation du

glucose ............................................................................................................................ 178

1. a. Observation de la localisation cellulaire de l'hexokinase KlHxk.......................... 178

1. b. Implication de KlHxk dans la signalisation du glucose : interaction avec KlRgt1 179

12

2. Hypothèse métabolique du signal issu de la glycolyse qui contrôle la signalisation du

glucose ............................................................................................................................ 180

2. a. Mesure de l'ATP dans différents mutants glycolytiques en présence de glucose

..................................................................................................................................... 180

2. b. Analyse métabolomique des dérivés de la glycolyse par chromatographie liquide

..................................................................................................................................... 182

3. Nature du signal glycolytique qui régule la stabilité du senseur du glucose Rag4 chez

K. lactis : discussion, conclusions et perspectives .......................................................... 194

IV. Conclusion, discussion et perspectives générales ..................................... 199

V. Matériels et Méthodes ............................................................................... 211

1. Souches et conditions de culture ................................................................................ 213

1. a. Les levures ........................................................................................................... 213

1. b. Les bactéries ........................................................................................................ 214

2. Méthodes de génétique et de biologie moléculaire ................................................... 214

2. a. Construction de souches de levures .................................................................... 214

2. b. Construction de plasmides .................................................................................. 215

2. c. Transformation .................................................................................................... 216

2. d. Manipulation des acides nucléiques ................................................................... 217

2. e. qRT-PCR : PCR quantitative après transcription réverse ..................................... 218

2. f. Mesure de l'activité d'un promoteur grâce à une construction reportrice ........ 220

3. Méthodes biochimiques ............................................................................................. 220

3. a. Extractions protéiques ......................................................................................... 220

3. b. Analyse de protéines par Western blot .............................................................. 225

3. c. Essai kinase .......................................................................................................... 227

4. Méthodes cellulaires : microscopie à fluorescence .................................................... 228

5. Méthodes d'analyse métabolomique ......................................................................... 228

5. a. Détermination de la corrélation DO

600 nm

/nombre de cellules et DO

600 nm

/masse

sèche pour les souches de levure K. lactis .................................................................. 229

5. b. Mesure de la quantité d'ATP cellulaire ............................................................... 229

5. c. Analyse des métabolites issus de la glycolyse par HPLC ..................................... 230

VI. Annexes .................................................................................................... 231

VII. Communications ...................................................................................... 257

VIII. Références .............................................................................................. 263

I. Contexte bibliographique

Le glucose (Figure 1) est la source d'énergie préférée pour les cellules de la majorité des

organismes vivants. Dans les plantes, le glucose est produit par photosynthèse. Chez les animaux, le glucose provient des glucides (mono- et di-saccharides, amidon) digérés dans l'intestin, ou de l'hydrolyse du glycogène dans le foie. Chez les microorganismes, le glucose est soit prélevé directement dans l'environnement, soit issu de l'hydrolyse de sucres plus complexes (lactose, maltose, saccharose). Il peut aussi provenir de l'hydrolyse de di- ou poly-

saccharides de réserve (tréhalose, glycogène) ou être synthétisé par néoglucogenèse grâce à

d'autres sources de carbone (acides aminés par exemple).

Figure 1: La molécule de glucose, C

6 H 12 0 6

Le glucose est métabolisé par les cellules vivantes grâce à la glycolyse pour générer de l'ATP

et de la biomasse. Le fructose est un autre hexose qui est métabolisé par la glycolyse et, comme le glucose, il se trouve naturellement dans les fruits. La glycolyse a lieu dans le cytoplasme des cellules et permet de transformer une molécule de glucose en deux molécules de pyruvate. La glycolyse permet de convertir deux molécules d'ADP en ATP, et deux molécules de NAD en NADH, selon la formule suivante :

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