[PDF] La réplication de lADN chez leuryarchaea Pyrococcus Abyssi : mise

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REMERCIEMENTS N° Ordre : 3338

de la thèse THESE présentée

DEVANT L'UNIVERSITE DE RENNES 1

pour obtenir le grade de : DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE RENNES 1

MENTION : BIOLOGIE

par

Christophe ROUILLON

Equipe d'accueil : Laboratoire de Microbiologie des environnements extrêmes, UMR 6197,

IFREMER, centre de Brest

Ecole doctorale : Université de Rennes1, Vie-Agro-Santé (VAS) Composante universitaire : Sciences de la Vie et de l'Environnement

LA REPLICATION DE L'ADN CHEZ L'EURYARCHAEA

PYROCOCCUS ABYSSI : MISE EN PLACE ET DYNAMIQUE DU

COMPLEXE

Soutenue le 19 juin 2006 devant la commission d'examen :

COMPOSITION DU JURY :

Professeur Daniel BOUJARD, Université de Rennes 1 Président Professeur Patrick FORTERRE, Université d'Orsay Rapporteur Docteur Robert FUCHS, IBSM Marseille Rapporteur Docteur Jean-Paul RAFFIN, UMR6197 Plouzané Directeur de thèse Docteur Gilbert SALBERT, Université de Renne 1 Examinateur Docteur Joël QUERELLOU, UMR6197 Plouzané Examinateur 1

REMERCIEMENTS

Nous sommes tous bons quand

nous donnons notre bon fond A mes collègues, amis, famille, voisins, passants...

A l'océan...

MERCI !

2

SOMMAIRE

SOMMAIRE

A INTRODUCTION GENERALE........................................................................ I NTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................ L ES ARCHAEA :........................................................................

I. Troisième règne du monde vivant........................................................................

............................13 II. Les grands groupes........................................................................ II I. Les thermococcales........................................................................ III.1. Le genre Pyrococcus :........................................................................ III.2. Pyrococcus abyssi........................................................................

IV. Caractères communs aux archées et aux eucaryotes........................................................................

..................16

V. Intérêt biotechnologique des archées thermophiles........................................................................

.....................18

VI. Thermostabilité et thermophilie........................................................................

L A REPLICATION DE L'ADN : ........................................................................ I. Notion de réplisomes :........................................................................

II. Le réplisome du bactériophage T4 :........................................................................

III. Le réplisome du procaryote bactérien Escherichia coli :...................................................................................26

IV. Le réplisome eucaryote : ........................................................................

V. Le réplisome archéen :.....................................................................

VI. Facteurs intervenant dans la phase d'élongation : ........................................................................

....................32 VI.1. Les ADN polymérases........................................................................

VI.1.1. Motifs et structures :........................................................................

V I.1.2. Interactions :........................................................................

VI.2. Le facteur de réplication PCNA :........................................................................

VI.2.1. Structure :........................................................................ V I.2.2. Fonctions du PCNA :...................................................................... VI.2.3. Interactions :........................................................................

VI.3. Le facteur de réplication RF-C : ........................................................................

VI.3.1. Fonctions du RF-C :........................................................................ VI.3.2. Structure :........................................................................ V I.3.3. Interactions :........................................................................

VI.4. Le facteur de stabilisation de l'ADN simple brin (RP-A)..............................................................................................44

VI.4.1. Fonctions du RP-A :........................................................................

VI.4.2. Organisation structurale et fixation sur l'ADN simple brin :..................................................................................46

VII. Etudes effectuées sur les facteurs intervenant dans la phase d'élongation du réplisome des euryarchées :

(tableau 2)........................................................................ 3

SOMMAIRE

MATERIELS ET METHODES........................................................................ P

ROTEINES RECOMBINANTES : CONSTRUCTIONS GENETIQUES ET MATERIEL PROTEIQUE..............................................54

I. Les ADN polymérases :........................................................................

I.1. Les ADN polymérases B et D :........................................................................

I.2. Les ADN polymérases ǻPIP :........................................................................

I.2.1. Conditions utilisées pour la mutagenèse dirigée........................................................................

................................55

I.2.2. Production et purification des protéines mutantes :...................................................................................................56

I.2.3. Révélation par Western Blot (figure 26) : ........................................................................

I.2.4. Production de l'ADN polymérase B ǻPIP par transcription/traduction in vitro :......................................................58

II. Les PCNAs : (30 kDa/monomère) ........................................................................

II.1. Le PCNA sauvage (PCNAwt) :........................................................................

II.2. Le PCNA(ded) : ........................................................................

II.2.1. Conditions de mutagenèse dirigée (tableau 4)........................................................................

..................................60

II.2.2. Contrôle et transformation en cellules d'expression ................................................................................................60

II.2.3. Production et purification de la protéine recombinante............................................................................................61

II.3. Les PCNAs phosphorylables (ph-PCNAwt et ph-PCNA(ded)) :..................................................................

...................66

II.3.1. Constructi

ons génétiques........................................................................

II.3.2. Production et purification de la protéine recombinante ; bilan :...............................................................................67

III. Le RF-C :........................................................................ IV. Le RP-A:........................................................................ T

ECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE.......................................................................69

I. Culture de Pyrococcus abyssi (souche GE5)........................................................................

................................69

II. Culture

s d'E. coli et souches utilisées........................................................................

III. Conditions de PCR........................................................................

III.1. PCR sur ADN génomique :........................................................................

III.2. PCR de contrôle sur clones :........................................................................

IV. Extraction de l'ADN........................................................................

IV.1. Extraction de l'ADN total de P. abyssi :........................................................................

IV.1.1. Préparation

du culot bactérien........................................................................ IV.2.

Extraction d'ADN plasmidique en petit volume (2 ml) et grand volume (50 ml) :........................................................72

V. Coupure de l'ADN par des enzymes de restriction :........................................................................

....................72

VI. Clonage en vecteur d'expression : ........................................................................

VI.1. Linéarisation du vecteur ; création des sites de clonage :...............................................................................................72

VI.2. Préparation des inserts :........................................................................

VI.3.

Ligature des inserts digérés et du vecteur linéarisé par la T4-ADN ligase :...................................................................73

VII. Transformation en cellules compétentes........................................................................

...................................73

VII.1. Transformation en cellule de maintenance........................................................................

VII.2. Transformation en cellules d'expression........................................................................

VIII. Mutagenèses dirigées........................................................................

IX. Visualisation de l'

ADN sur gel d'agarose........................................................................ ..................................74

X. Séque

nçage de l'ADN........................................................................ XI.

Linéarisation de la matrice M13mp18 simple brin circulaire............................................................................75

T

ECHNIQUES DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DE PROTEINES RECOMBINANTES....................................................77

I. Expressions de protéines recombinantes........................................................................

......................................77

I.1. Expressions en petits volumes :........................................................................

I.2. Expression en grands volumes :........................................................................

4

SOMMAIRE

I.3. Expression par un système de transcription/traduction in vitro........................................................................

................77

II. Visualisation des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) ...............................................78

II.1. Préparation de

s échantillons :........................................................................ II.2. Migration :........................................................................

II.3. Révélation et séchage des gels : ........................................................................

III. Pur

IV. Dosage des protéines : ........................................................................

V.

Obtention de séquences peptidiques........................................................................

V.1. Séquençage N-terminal par la méthode d'Edman :........................................................................

.................................80

V.2. Spectrométrie de masse........................................................................

VI. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression......................................................................80

VII. Test d'activité des ADN polymérases :........................................................................

......................................81

VII.1. Matrice d'ADN utilisée :........................................................................

VII.2. Réaction :........................................................................ V II.3. Comptage : ........................................................................ M

ETHODES DE BIOCHIMIE FONCTIONNELLE ET INTERACTIONS........................................................................

..............82

I. Chargement du PCNA par réaction de pontage au glutaraldéhyde :...................................................................82

I.1. Principe (figure 39) :........................................................................

I.2. Phosphorylation du PCNA :........................................................................

I.3. Préparation de la matrice d'ADN amorcée :........................................................................

I.4. Chargement et visualisation du complexe ADN/PCNA :........................................................................

.........................83

I.4.1. Réaction de chargement........................................................................

I.4.2. Electrophorèse et révélation........................................................................

II. Synthèse d'ADN in vitro : (figure 40)........................................................................

II.1. Matrice

d'ADN amorcé :........................................................................

II.2. Réaction d'élongation : ........................................................................

II.3. Gel alcalin :........................................................................

II.3.1. Préparation du gel :........................................................................

II.3.2. La migration :........................................................................

II.3.3. Séchage et révélation :........................................................................

II.3.4

. Marqueur de taille........................................................................

III. Interactions des protéines

avec un ADN simple brin amorcé ............................................................................86

III.1. Visualisation pa

r western blot :........................................................................

III.1.1. principe (figure 41)........................................................................

III.1.2. Matrice d'ADN utilisée........................................................................

III.1.3. Utilisation de billes magnétiques streptavidinées ...................................................................................................87

III.1.4. Ajout des protéines :........................................................................

III.1.5. Western Blot et révélation par anticorps :........................................................................

III.2. Résonance plasmonique de surface :........................................................................

III.2.1. Principe de la résonance plasmonique de surface...................................................................................................88

III.2.2. Principe de fonctionnement de l'appareillage utilisé (Biacore X) ..........................................................................89

III.2.3. Expériences réalisées........................................................................

I. Et ude du chargement du PCNA :........................................................................

I.1. Le PCNA de P. abyssi se charge sur l'ADN en absence de RF-C :........................................................................

..........92

I.2. Importance de la structure trimérique du PCNA........................................................................

I.2.1. Obtention d'un PCNA mutant incapable de former un trimère :...............................................................................94

5

SOMMAIRE

I.2.2. Le PCNA(ded) ne forme pas de trimère en solution :................................................................................................96

I.2.3. Le marquage du PCNA(ded) est plus efficace que celui du PCNA sauvage.............................................................97

I.2.4. Le PCNA(ded) n'interagit pas avec l'ADN........................................................................

I.3. Stoechiométrie fonctionnelle du RF-C........................................................................

I.4. Quantification de l'inte

nsité du signal de chargement......................................................................................................99

I.5. Le RF-C est-il un facteur de déchargement ?........................................................................

I.6. Stabilité du complexe PCNA/ADN :........................................................................

I.7. L'ADN polymérase B stimule le chargement du PCNA........................................................................

........................104

I.8. Visualisation d'un complexe fonctionnel ........................................................................

I.8.1. Elongation de l'amorce par l'ADN polymérase B........................................................................

...........................106

I.8.2. Importance de la nature de l'amorce ........................................................................

II. Etude de la synthèse d'ADN par les ADN polymérases B et D en présence des facteurs accessoires ..............108

II.1. Temps d'incubation en présence de l'ADN polymérase B :..........................................................................................108

II.2. Le PCNA : facteur de processivité pour l'ADN polymérase B.....................................................................................109

II.3. Le RF-C déstabilise le complexe PCNA/ADN polymérase B :.....................................................................................110

II.4. Le RF-C n'a pas d'influence sur l'activité du complexe PCNA/ADN polymérase D :.................................................112

III. Importance des motifs d'interaction avec le PCNA........................................................................

.................114

IV. Les ADN polymérases ǻPIP........................................................................

IV.1. La synthèse d'ADN effectuée par l'ADN polymérase B ǻPIP n'est plus stimulée par le PCNA................................115

IV.2. L'ADN polymérase D

ǻPIP interagit physiquement avec le PCNA........................................................................

....116

IV.3. Le chargement spontané du PCNA est aboli en présence de l'ADN polymérase B ǻPIP............................................117

V. Visualisation par pull-down des complexes au niveau d'un ADN simple brin amorcé :...................................118

V.1. Affinité du PCNA pour l'ADN et influence de la température.....................................................................................118

V.1.1. Affinité : ........................................................................

V.1.2. Influence de la température :........................................................................

V.2. Le comple

xe RF-C/PCNA ........................................................................

V.2.1. Devenir du RF-C après chargement :........................................................................

V.2.2. Formation d'un complexe ADN-indépendant :........................................................................

..............................122

V.3. Présence des ADN polymérases au niveau de l'ADN simple brin amorcé ...................................................................124

V.3.1. Reconnaissance de l'amorce et recrutement sur le PCNA :...................................................................................124

V.3.2. Déplacement de l'ADN polymérase D par l'ADN polymérase B :........................................................................124

V.4. Stabilité du complexe RF-C/PCNA en présence des ADN polymérases ......................................................................128

V.4.1. Influence de l'ADN polymérase B :........................................................................

V.4.2. Influence de l'ADN polymérase D :........................................................................

DISCUSSION ........................................................................ CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES........................................................................ C P REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................ 6

SOMMAIRE

ANNEXE

1 : TRAVAUX EFFECTUES SUR LE RP-A ........................................................................

..............................164

I. Obtention des constructions plasmidiques portant les gènes du RP-A :.............................................................164

I.1. Sélection et amplification :........................................................................

I.2. Clonage en vecteur d'expression :........................................................................

II. Expression des protéines recombinantes :........................................................................

.................................166

II.1. Obtention d'une protéine RP-A1 tronquée :........................................................................

II.2. Obtention de la

protéine RP-A2 :........................................................................ II.3.

La protéine RP-A3 n'est pas exprimée :........................................................................

II.4. Expression de l'opéron

RP-A :........................................................................

III. Coexpression des trois sous unités du RP-A ........................................................................

............................170

III.1. Purification de l'extrait protéique sur colonne d'ADN simple brin : ...........................................................................171

III.2. Analyse par spectrométrie de masse : ........................................................................

IV. Travaux en cours et perspectives : ........................................................................

ANNEXE

2 : TAMPONS........................................................................

I. Milieux de culture........................................................................

II. Tampons d'électrophorèse SDS-Page :........................................................................

.....................175

III. Tampons de lyse cellulaire........................................................................

IV. Tampons de purification........................................................................

ANNEXE

3 : FICHES D'IDENTITE DES PROTEINES........................................................................

...............................177 I. PabPol B........................................................................ II. PabPol D........................................................................ III. PabPCNA........................................................................

IV. PabRF

7

Abréviations

ADN :

Acide DesoxyRiboNucléique

ARN :

Acide RiboNucléique

ATP : Adenosine TriPhosphate

BER : Ba

se Excision Repair Cdk :

Cyclin dependant kinase

Ctf1 :

Chromosome transmission fidelity factor

dNTP : desoxyribo Nucleotide Tri Phosphate

DSBR : Double strand Break Repair

ERCC :

Excision Repair Cross-Complementing

Fen-1 : Flap Endonuclease

FRET :

Fluorescence Resonance Energy Transfert

Gadd: Growth Arrest and DNA Damage

LUCA :

Last universal common ancestor

MCM : Mini Chromosome Maintenance

MMR : MisMatch Repair

MyD : My

eloid Differentiation NER :

Nucleic Excision Repair

ORC : Origin Recognition Complex

PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen

PCR : Poly

m erase Chain Reaction

PIP : PCNA Interacting Protein

Pol :

ADN polymérase

RP-A : Replication Protein A

RP-C : Replication Factor C

SDS-PAGE :

quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44

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