Quelles sont les ADN polymérases requises pour la réplication et la
chez les eucaryotes? Lors de la synthèse d'ADN la polymérisation de désoxyri- bonucléotides s'effectue grâce à des enzymes spécifiques: les ADN polymérases
CHAPITRE 2 BIOLOGIE MOLECULAIRE Mme OUNIS.pdf
Les eucaryotes ont des origines multiples sur chaque chromosome (chez la levure Les ADN polymérases des procaryotes et des eucaryotes ne peuvent ...
REPLICATION DE LADN
Elles sont de 3 types (I II et III) pour les procaryotes et les ADN polymérases eucaryotes de. 5 types (?
La réplication dADN-Biologie Moléculaire-Dahmani.pdf
chez les procaryotes. (9 ADN polymérases chez les eucaryotes). ? La polymérase alpha/primase. Cette polymérase est impliqué dans l
La structure des acides nucléiques
Comprendre la réplication chez les procaryotes et les eucaryotes Eucaryotes: 5 types d'ADN polymérases: ADN Pol ? ?
MODULE :
d- Les DNA polymérases I des procaryotes ont une activité5' 3' exonucléasique. e- Les amorces des ADN polymérase eucaryotes peuvent être du DNA double brin. f-
La réplication de lADN chez leuryarchaea Pyrococcus Abyssi : mise
eucaryotes a été faite lors de l'étude des ARN polymérases ADN dépendantes (Huet et al. 1983). Bien que les régulations transcriptionnelles archées soient
Fonction et régulation de lADN polymérase spécialisée eta dans la
19 déc. 2021 Figure 4 : Représentation schématique du réplisome Eucaryote. Figure 5 : Structure en « main droite » des ADN polymérases réplicatives.
« Les ADN polymérases B et D de lArchaea hyperthermophile
CHAPITRE 3 - ETUDE D'UN MOTIF RICHE EN GLYCINES DE L'ADN POLYMERASE D DE des protéines de type eucaryote pour les processus informatifs.
Which eukaryotic polymerase requires a specific set of transcription factors?
Each eukaryotic polymerase also requires a distinct set of transcription factors to bring it to the DNA template. RNA polymerase I is located in the nucleolus, a specialized nuclear substructure in which ribosomal RNA (rRNA) is transcribed, processed, and assembled into ribosomes.
Which enzyme removes RNA primers?
RNA primers need to be replaced with DNA, and nicks in the sugar-phosphate backbone need to be connected. The group of cellular enzymes that remove RNA primers include the proteins FEN1 (flap endonulcease 1) and RNase H.
What dnaps do eukaryotes use for replication?
Eukaryotes utilise various multimeric DNAPs for replication of the genome; namely Pol a, Pol d and Pol e (Burgers, 2009). All contain a catalytic core identifiable as a Family B polymerase, along with various accessory subunits fundamental to their roles in replication (Hubscher et al., 2002).
What are the types of DNA polymerases?
Based on the sequence similarity and enzymatic properties, DNA polymerases are classified into six main groups: families A, B, C, D, X, and Y . Families B and C are eukaryotic and bacterial replicative DNA polymerases, respectively [2, 3].
REMERCIEMENTS N° Ordre : 3338
de la thèse THESE présentéeDEVANT L'UNIVERSITE DE RENNES 1
pour obtenir le grade de : DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE RENNES 1MENTION : BIOLOGIE
parChristophe ROUILLON
Equipe d'accueil : Laboratoire de Microbiologie des environnements extrêmes, UMR 6197,IFREMER, centre de Brest
Ecole doctorale : Université de Rennes1, Vie-Agro-Santé (VAS) Composante universitaire : Sciences de la Vie et de l'EnvironnementLA REPLICATION DE L'ADN CHEZ L'EURYARCHAEA
PYROCOCCUS ABYSSI : MISE EN PLACE ET DYNAMIQUE DU
COMPLEXE
Soutenue le 19 juin 2006 devant la commission d'examen :COMPOSITION DU JURY :
Professeur Daniel BOUJARD, Université de Rennes 1 Président Professeur Patrick FORTERRE, Université d'Orsay Rapporteur Docteur Robert FUCHS, IBSM Marseille Rapporteur Docteur Jean-Paul RAFFIN, UMR6197 Plouzané Directeur de thèse Docteur Gilbert SALBERT, Université de Renne 1 Examinateur Docteur Joël QUERELLOU, UMR6197 Plouzané Examinateur 1REMERCIEMENTS
Nous sommes tous bons quand
nous donnons notre bon fond A mes collègues, amis, famille, voisins, passants...A l'océan...
MERCI !
2SOMMAIRE
SOMMAIRE
A INTRODUCTION GENERALE........................................................................ I NTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................ L ES ARCHAEA :........................................................................I. Troisième règne du monde vivant........................................................................
............................13 II. Les grands groupes........................................................................ II I. Les thermococcales........................................................................ III.1. Le genre Pyrococcus :........................................................................ III.2. Pyrococcus abyssi........................................................................IV. Caractères communs aux archées et aux eucaryotes........................................................................
..................16V. Intérêt biotechnologique des archées thermophiles........................................................................
.....................18VI. Thermostabilité et thermophilie........................................................................
L A REPLICATION DE L'ADN : ........................................................................ I. Notion de réplisomes :........................................................................II. Le réplisome du bactériophage T4 :........................................................................
III. Le réplisome du procaryote bactérien Escherichia coli :...................................................................................26
IV. Le réplisome eucaryote : ........................................................................
V. Le réplisome archéen :.....................................................................VI. Facteurs intervenant dans la phase d'élongation : ........................................................................
....................32 VI.1. Les ADN polymérases........................................................................VI.1.1. Motifs et structures :........................................................................
V I.1.2. Interactions :........................................................................VI.2. Le facteur de réplication PCNA :........................................................................
VI.2.1. Structure :........................................................................ V I.2.2. Fonctions du PCNA :...................................................................... VI.2.3. Interactions :........................................................................VI.3. Le facteur de réplication RF-C : ........................................................................
VI.3.1. Fonctions du RF-C :........................................................................ VI.3.2. Structure :........................................................................ V I.3.3. Interactions :........................................................................VI.4. Le facteur de stabilisation de l'ADN simple brin (RP-A)..............................................................................................44
VI.4.1. Fonctions du RP-A :........................................................................VI.4.2. Organisation structurale et fixation sur l'ADN simple brin :..................................................................................46
VII. Etudes effectuées sur les facteurs intervenant dans la phase d'élongation du réplisome des euryarchées :
(tableau 2)........................................................................ 3SOMMAIRE
MATERIELS ET METHODES........................................................................ PROTEINES RECOMBINANTES : CONSTRUCTIONS GENETIQUES ET MATERIEL PROTEIQUE..............................................54
I. Les ADN polymérases :........................................................................I.1. Les ADN polymérases B et D :........................................................................
I.2. Les ADN polymérases ǻPIP :........................................................................
I.2.1. Conditions utilisées pour la mutagenèse dirigée........................................................................
................................55I.2.2. Production et purification des protéines mutantes :...................................................................................................56
I.2.3. Révélation par Western Blot (figure 26) : ........................................................................
I.2.4. Production de l'ADN polymérase B ǻPIP par transcription/traduction in vitro :......................................................58
II. Les PCNAs : (30 kDa/monomère) ........................................................................
II.1. Le PCNA sauvage (PCNAwt) :........................................................................
II.2. Le PCNA(ded) : ........................................................................II.2.1. Conditions de mutagenèse dirigée (tableau 4)........................................................................
..................................60II.2.2. Contrôle et transformation en cellules d'expression ................................................................................................60
II.2.3. Production et purification de la protéine recombinante............................................................................................61
II.3. Les PCNAs phosphorylables (ph-PCNAwt et ph-PCNA(ded)) :..................................................................
...................66II.3.1. Constructi
ons génétiques........................................................................II.3.2. Production et purification de la protéine recombinante ; bilan :...............................................................................67
III. Le RF-C :........................................................................ IV. Le RP-A:........................................................................ TECHNIQUES DE CULTURE CELLULAIRE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE.......................................................................69
I. Culture de Pyrococcus abyssi (souche GE5)........................................................................
................................69II. Culture
s d'E. coli et souches utilisées........................................................................
III. Conditions de PCR........................................................................III.1. PCR sur ADN génomique :........................................................................
III.2. PCR de contrôle sur clones :........................................................................
IV. Extraction de l'ADN........................................................................IV.1. Extraction de l'ADN total de P. abyssi :........................................................................
IV.1.1. Préparation
du culot bactérien........................................................................ IV.2.Extraction d'ADN plasmidique en petit volume (2 ml) et grand volume (50 ml) :........................................................72
V. Coupure de l'ADN par des enzymes de restriction :........................................................................
....................72VI. Clonage en vecteur d'expression : ........................................................................
VI.1. Linéarisation du vecteur ; création des sites de clonage :...............................................................................................72
VI.2. Préparation des inserts :........................................................................
VI.3.Ligature des inserts digérés et du vecteur linéarisé par la T4-ADN ligase :...................................................................73
VII. Transformation en cellules compétentes........................................................................
...................................73VII.1. Transformation en cellule de maintenance........................................................................
VII.2. Transformation en cellules d'expression........................................................................
VIII. Mutagenèses dirigées........................................................................
IX. Visualisation de l'
ADN sur gel d'agarose........................................................................ ..................................74X. Séque
nçage de l'ADN........................................................................ XI.Linéarisation de la matrice M13mp18 simple brin circulaire............................................................................75
TECHNIQUES DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION DE PROTEINES RECOMBINANTES....................................................77
I. Expressions de protéines recombinantes........................................................................
......................................77I.1. Expressions en petits volumes :........................................................................
I.2. Expression en grands volumes :........................................................................
4SOMMAIRE
I.3. Expression par un système de transcription/traduction in vitro........................................................................
................77II. Visualisation des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant (SDS-PAGE) ...............................................78
II.1. Préparation de
s échantillons :........................................................................ II.2. Migration :........................................................................II.3. Révélation et séchage des gels : ........................................................................
III. Pur
IV. Dosage des protéines : ........................................................................
V.Obtention de séquences peptidiques........................................................................
V.1. Séquençage N-terminal par la méthode d'Edman :........................................................................
.................................80V.2. Spectrométrie de masse........................................................................
VI. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression......................................................................80
VII. Test d'activité des ADN polymérases :........................................................................
......................................81VII.1. Matrice d'ADN utilisée :........................................................................
VII.2. Réaction :........................................................................ V II.3. Comptage : ........................................................................ METHODES DE BIOCHIMIE FONCTIONNELLE ET INTERACTIONS........................................................................
..............82I. Chargement du PCNA par réaction de pontage au glutaraldéhyde :...................................................................82
I.1. Principe (figure 39) :........................................................................I.2. Phosphorylation du PCNA :........................................................................
I.3. Préparation de la matrice d'ADN amorcée :........................................................................
I.4. Chargement et visualisation du complexe ADN/PCNA :........................................................................
.........................83I.4.1. Réaction de chargement........................................................................
I.4.2. Electrophorèse et révélation........................................................................
II. Synthèse d'ADN in vitro : (figure 40)........................................................................
II.1. Matrice
d'ADN amorcé :........................................................................II.2. Réaction d'élongation : ........................................................................
II.3. Gel alcalin :........................................................................II.3.1. Préparation du gel :........................................................................
II.3.2. La migration :........................................................................II.3.3. Séchage et révélation :........................................................................
II.3.4
. Marqueur de taille........................................................................III. Interactions des protéines
avec un ADN simple brin amorcé ............................................................................86
III.1. Visualisation pa
r western blot :........................................................................III.1.1. principe (figure 41)........................................................................
III.1.2. Matrice d'ADN utilisée........................................................................
III.1.3. Utilisation de billes magnétiques streptavidinées ...................................................................................................87
III.1.4. Ajout des protéines :........................................................................
III.1.5. Western Blot et révélation par anticorps :........................................................................
III.2. Résonance plasmonique de surface :........................................................................
III.2.1. Principe de la résonance plasmonique de surface...................................................................................................88
III.2.2. Principe de fonctionnement de l'appareillage utilisé (Biacore X) ..........................................................................89
III.2.3. Expériences réalisées........................................................................
I. Et ude du chargement du PCNA :........................................................................I.1. Le PCNA de P. abyssi se charge sur l'ADN en absence de RF-C :........................................................................
..........92I.2. Importance de la structure trimérique du PCNA........................................................................
I.2.1. Obtention d'un PCNA mutant incapable de former un trimère :...............................................................................94
5SOMMAIRE
I.2.2. Le PCNA(ded) ne forme pas de trimère en solution :................................................................................................96
I.2.3. Le marquage du PCNA(ded) est plus efficace que celui du PCNA sauvage.............................................................97
I.2.4. Le PCNA(ded) n'interagit pas avec l'ADN........................................................................
I.3. Stoechiométrie fonctionnelle du RF-C........................................................................
I.4. Quantification de l'inte
nsité du signal de chargement......................................................................................................99
I.5. Le RF-C est-il un facteur de déchargement ?........................................................................
I.6. Stabilité du complexe PCNA/ADN :........................................................................
I.7. L'ADN polymérase B stimule le chargement du PCNA........................................................................
........................104I.8. Visualisation d'un complexe fonctionnel ........................................................................
I.8.1. Elongation de l'amorce par l'ADN polymérase B........................................................................
...........................106I.8.2. Importance de la nature de l'amorce ........................................................................
II. Etude de la synthèse d'ADN par les ADN polymérases B et D en présence des facteurs accessoires ..............108
II.1. Temps d'incubation en présence de l'ADN polymérase B :..........................................................................................108
II.2. Le PCNA : facteur de processivité pour l'ADN polymérase B.....................................................................................109
II.3. Le RF-C déstabilise le complexe PCNA/ADN polymérase B :.....................................................................................110
II.4. Le RF-C n'a pas d'influence sur l'activité du complexe PCNA/ADN polymérase D :.................................................112
III. Importance des motifs d'interaction avec le PCNA........................................................................
.................114IV. Les ADN polymérases ǻPIP........................................................................
IV.1. La synthèse d'ADN effectuée par l'ADN polymérase B ǻPIP n'est plus stimulée par le PCNA................................115
IV.2. L'ADN polymérase D
ǻPIP interagit physiquement avec le PCNA........................................................................
....116IV.3. Le chargement spontané du PCNA est aboli en présence de l'ADN polymérase B ǻPIP............................................117
V. Visualisation par pull-down des complexes au niveau d'un ADN simple brin amorcé :...................................118
V.1. Affinité du PCNA pour l'ADN et influence de la température.....................................................................................118
V.1.1. Affinité : ........................................................................V.1.2. Influence de la température :........................................................................
V.2. Le comple
xe RF-C/PCNA ........................................................................V.2.1. Devenir du RF-C après chargement :........................................................................
V.2.2. Formation d'un complexe ADN-indépendant :........................................................................
..............................122V.3. Présence des ADN polymérases au niveau de l'ADN simple brin amorcé ...................................................................124
V.3.1. Reconnaissance de l'amorce et recrutement sur le PCNA :...................................................................................124
V.3.2. Déplacement de l'ADN polymérase D par l'ADN polymérase B :........................................................................124
V.4. Stabilité du complexe RF-C/PCNA en présence des ADN polymérases ......................................................................128
V.4.1. Influence de l'ADN polymérase B :........................................................................
V.4.2. Influence de l'ADN polymérase D :........................................................................
DISCUSSION ........................................................................ CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES........................................................................ C P REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................ 6SOMMAIRE
ANNEXE
1 : TRAVAUX EFFECTUES SUR LE RP-A ........................................................................
..............................164I. Obtention des constructions plasmidiques portant les gènes du RP-A :.............................................................164
I.1. Sélection et amplification :........................................................................
I.2. Clonage en vecteur d'expression :........................................................................
II. Expression des protéines recombinantes :........................................................................
.................................166II.1. Obtention d'une protéine RP-A1 tronquée :........................................................................
II.2. Obtention de la
protéine RP-A2 :........................................................................ II.3.La protéine RP-A3 n'est pas exprimée :........................................................................
II.4. Expression de l'opéron
RP-A :........................................................................III. Coexpression des trois sous unités du RP-A ........................................................................
............................170III.1. Purification de l'extrait protéique sur colonne d'ADN simple brin : ...........................................................................171
III.2. Analyse par spectrométrie de masse : ........................................................................
IV. Travaux en cours et perspectives : ........................................................................
ANNEXE
2 : TAMPONS........................................................................
I. Milieux de culture........................................................................II. Tampons d'électrophorèse SDS-Page :........................................................................
.....................175III. Tampons de lyse cellulaire........................................................................
IV. Tampons de purification........................................................................ANNEXE
3 : FICHES D'IDENTITE DES PROTEINES........................................................................
...............................177 I. PabPol B........................................................................ II. PabPol D........................................................................ III. PabPCNA........................................................................IV. PabRF
7Abréviations
ADN :Acide DesoxyRiboNucléique
ARN :quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44[PDF] les grands classiques de la littérature française
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