[PDF] MODULE 1 – Introduction Comment préparer un prélèvement de

2 Danscettevidéonousallonsparlerd'aspectsplustechniquesliésàl'histologie.Savez-vouscommentonobtientunelamehistologiquecommecelle-ci?Etbienpourledécouvrirouleredécouvrir,jevousproposederejoin dreunl aboratoired'analyse safindecompre ndrecommentlestissusbiologiquessonttraitéspourpréparerleslameshistologiquesquiserontobservéessouslemicroscope.NousvoicidanslelaboratoirededermatopathologieducentrehospitalieruniversitairedeLiège.Ici,plusieurscentainesdelameshistologiquessontpréparéeschaquejouretnousallonspouvoirobserverchaqueétapedecettepréparationminutieuse.Lapremièreétapedeceprocessusestleprélèvementquiconsisteàobtenirunéchantillondetissusenlecoupanthorsd'unorganeoumêmeàpréleverunorganeentier.Enclinique,unfragmen td'organeestprélevé lorsd'uneendoscopieo ulorsd' uneinterventionchirurgicale.Onparlerespectivementdebiopsieoudepièceopératoire.Deséchantillonsdetissuspeuventaussiêtreprélevéssurdescadavreslorsd'autopsies.Danslelaborato ire,les prélèvementsreçussontanalysés macroscopiq uementet,sinécessaire,ilssontrecoupéspourobtenirdespiècesdepetitetaille,d'environ1à2cm2,quisontalorsdéposéesdansdescassettesd'inclusionenplastiqueservantdecontenantpourlasuitedelamanipulation.Afindeconserverlestissusprélevésdansunétatprocheduvivant,ilssontfixéstoutdesuiteaprèsleprélèvementàl'aided'unesubstancechimiquequel'onappellelefixateur.Généralement,ils'agitdeformoloudeparaformaldéhydeàdesconcentrationsdéterminéesmaisd'autrestypesdefixateurspeuventaussiêtreutilisés,celadépendprincipalementdutyped'examenàeffectuerparlasuitesurletissumaisaussidutempsdisponiblepourlafixation.Eneffet,laduréedelafixationvarieselonlatailleduprélèvement.Atitred'exemple,lavitessedepénétrationduformoldanslestissusestde1millimètreparheure.Lesintérêtsdelafixati onsontmultiples:immo bilisationdesconstituantstissulairesetcel lulaires,préventiondel'autolysecellulaireetdelaputréfactionbactériennepost-mortem.Pourpouvoirobserverlestissusaumicroscope,ilfautréaliserdefinestranchesrégulièresdansleprélè vement.Po uryparvenir,celui-cidoitavo irunecons istancesolide,c 'estpourquoiilestinclusdansdelaparaffine.C'estcequel' onappelle laphased'in clusionquies tgénéralementréalisée dansun automate.Laparaffineétanthydrophobe,lestissusdoiventêtrepréalablementdéshydratéspardespassagessuccessifsdansdesbainsd'alcooldeconcentrationcroissante,puisdansun

3solvantdanslequellaparaffineestmiscible,parexemplelexylèneouletoluène.Acestade,leprélèvementdevienttransparent,c'estlaclarification.Alafindel'étaped'inclusion,lesprélèvementssontplongésdansdesbainsdeparaffineliquidequioccuperatouslesespacesvidesdansletissu.Alasortiedel'automate,leprélevementestsortidesacassetted'inclusionetdéposédansunmoulequipeutêtreremplideparaffine,c'estlaphased'enrobage.Enrefroidissant,laparaffinedurcira,cequiformeraunblocdanslequell'échantillondetissusestinclusetquipourraêtrecoupéenfinestranchesquel'onappelledescoupes.Parfoisunexamentrèsr apidedes tissusestnécessai re,parexemp lepourunexamen extemporanéc'est-à-direpourguide rlechirurgie nensalled'opération. Danscec as,leprélèvementestfixépuiscongeléetinclusdansunmélangehydrosolubledeglycolsetderésinespourréaliserlescoupes.Cettetechniquepermetd'écourterleprocessusenévitantlesétapesd'inclusionetd'enrobageenparaffine.Silepré lèvement aétéinclusdanslaparaf fine, leblocestalorscoupéàl'ai ded'un microtome.Sileprélèvementaétécongelé,lescoupessontréaliséesdansuneenceinteréfrigéréeàl'aided'unemachineappeléecryostat.Lemicrotomeetlecryostatsontdesappareilsmunisd'unelameaiguiséequipermettentd'obtenirdescoupesdetiss usfines,de 2à5micromètresd'é paisseur. Audelàde5micromètres,ilestdifficiled'observercorrectementleprélèvementaumicroscopecarlescouchesdetissussesuperposent.Lesfinescoupesréaliséessontensuitedéposéessurdeslamesdeverrepuisséchéesafind'adhérerparfaitementàlalame.Dansleslaboratoiresd'analysecommecelui-ci,c'estunautomatequisechargeradelasuitedesétapesdelapréparation.Lescoupesyserontdéparaffinéesetréhydratéesparpassagessuccessifsdansdesbainsd'alcooldemoinsenmoinsconcentréetenfinparpassagedansunbaind'eaupourpouvoirêtrecolorées.Puisquelestissusdel'organismenesontpasspontanémentcolorés,ilsserontnaturellementmalvisibl es,c'estpourquoionutilisee nhistologiede scolorantsquipermettentleur observationaumicroscope.Laplupartsontdescomposantsacidesoubasiquesenmilieuaqueuxquiinteragissentaveclesradicauxionisésdestissus.Lacolorationlapluscourammentutiliséeestl'hématoxyline-éosine.Cettecolorationestlatechniquedecontrastefondamen talepourto utexamenmicroscopiqu ehistologiqueconventionnel.L'hématoxylineestuncolorantbasique,quisefixeauxacidesnucléiquesetcoloreainsilesnoyau xcellulaireset leréticulum endoplasmiquerug ueuxenviolet.Au

4contraire,l'éosineestunco lorantacide,quisefixeaux protéines etdoncc olorelecytoplasmeetlesfibresenrose.Uneautrecolorationfréquenteestl'hématoxyline-éosine-safran,cederniercolorantauneaffinitéaveclesfibresdecollagènedelamatriceextracellulairedestissusetpermetdoncdemettrecesfibresenévidence.Lacolo rationtrichromedeMassone stelleaussicl assiquemen tutiliséeenlab oratoire,surtoutpouridentifierlespathologiesmusculaires,cardiaques,hépatiquesetrénalescarellepermetdebiendifférencierd'unepartlesfibresmusculairesdontlecytoplasmeprendunecolorationrougeetd'autrepartlesfibresdecollagènequisecolorentenvert.Ilexis teévidemmentbien d'autrespossibilitésdecoloratio ndestissusqu evousrencontrerezsurleslameshistologiquesquevousobserverezdansceMOOC.Desréactionschimiquesplusspécifiquespeuventaussiparfoisêtreutiliséespourmettreenévidencecertainesstructures.Prenonsquelquesexemples.Lemucusprésentdanscertainstissuspeutêtrecoloréparexempleàl'aideduBleu Alc ianouduRougeMuci carminqui colorentles mucopolysaccharidesacidesrespectivementenbleuouenrouge.Unautreexempleestceluidelacolorationàl'acidepériodiquedeSchiffquel'onappelleplussouventcolorationPASquimetenévidencelesglucidesparuncolorantrouge-pourpre.Cettecolorati onpermetparexempledemie uxvisualiserleg lycogène oulesmucinescontenusdanscertainescellulesouencoreleslamesbasalesdesépithéliumsquisontrichesenglycoprotéines.Nousévoqueronsaussiplustardlacolorationàl'orcéinequiestunecolorationspécifiquedesfibresélastiquesquel'ontrouvedanslestissusconjonctifs,maisaussil'imprégnationàl'argentquipermetdevisualiserlesfibresdecollagènedetypeIIIappeléesaussifibresréticuléesetfinalementlafixationàl'acideosmiquequipermetdeconserveretvisualiserleslipidesdestissusbiologiques.Finalementd'autrestechniques, ditesd'immunohistoch imie,peuventêtreutiliséespourmettreenévidencedesmotifsantigéniquesprésentsdanslestissus.Ellessontcourammentutiliséesenrechercheetdansleslaboratoiresdediagnostic.Ellesconsistentàutiliserdesanticorpsspécifiquesdemoléculesd'intérêtafind'évaluerleurprésenceetleurrépartitiondansuntissu. Laréactio nantigène-anticorpsestvisualiséeso itparune réactionenzymatiquesoitàl'aidedesub stanceschimiq ues appeléesfluorochromes.Pourlaréalisationdecestechniques,lacongélationdestissusestaussipréférablecarellepermetunemeilleureconservationdessitesantigéniquesdansletissu.Ladernièreétapedelapréparationdeslameshistologiquesestlemontage.Lorsqueletissuaété coloré, ilfautleprotégerparl'ap position d'unerés ineetd'u nelamelledeverre

5couvre-objetoubienparunfilmplastique,commec'estlecasdanscetautomate.Cecipermettradeconserverlalameetdel'observeraumicroscopesansrisqued'abîmerletissu.Voussavezmaintenan tcommenton réalisedeslameshisto logiquesàpartird'un prélèvementdetissu.Pourobserverceslameshistologiques,vouspouvezbiensûrutiliserunmicroscopecommecelui-cimaisdeplusenplusfréquemmentdanslapratiquemédicale,pourlarechercheoudansl'enseignement,commedansceMOOCparexemple,ceslamessontdigitaliséespourpouvoirêtreregardéessurunordinateur.Voyonsenquelquesmotsenquoiconsisteleprocessusdedigitalisation.Ladigitalisation,c'estl'obtentiond'uneimagenumériqueàpartird'unelamehistologiquegrâceàunscannerparticulierdotéd'unmicroscopeetd'unecaméradigitale.Leprocessusd'acquisitiondel'imagedébuteparlechoix,àfaiblegrossissement,delapartiedelalameànumériseretparleréglagedeparamètrestelsquelanetteté.Lanumérisationproprementditepeutalorsavoirlieu.Desmilliersd'imagesdelacoupehistologiquefourniesparl'objectifdumicroscoperégléàl'agrandissementmaximumchoisisontenregis tréesdemanièresérielle,puisregro upéespo urreconstruirelatotali tédel'échantillon.L'observationdeslamesnumériséessefaitsurl'écrand'unordinateuràl'aided'unlogicieldevisualisation,quireproduitlesfonctionsd'unmicroscopeenpermettantdenaviguersurlalameàdifférentsgrossissements.Leslamesscan néesprésentent denombreuxavantagescomme notammentunaccèspartagéentredenombreusespersonnes,uneconsultationàdistanceetàtoutmoment.Ellespermettentégalementdepointercertainesstructuresd'intérêtetd'incorporerdescommentairessurl'image.DansceMOOC,vousaurezdoncunmicroscopevirtuelàvotredispositionaveclequelvouspourrezexploreràvotreguisenoslamesdigitaliséesmaisaussivouslaisserguideràtraverslestissuslelongdeparcoursdequestions-réponsesquenousavonspréparéspourvous.