[PDF] Dosage dun analyte S par méthode enzymatique en phase aqueuse

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\analyschim\doseS-Ez-pointfinal JF Perrin maj 2017 page 1/ 4 Dosage d'un analyte S par méthode enzymatique en phase aqueuse homogène au point final de la réaction.

1. Principe des méthodes enzymatiques de dosage en phase aqueuse homogène au point

final de la réaction avec lecture d'absorbance

Soit à doser un analyte S dans un milieu (biologique) complexe contenant S et bien d'autres molécules.

On suppose qu'on dispose d'une enzyme Ez catalysant spécifiquement la réaction

S + R bbbr P + Q

et telle que la réaction soit totale, réalisée en excès stoechiométrique de R par rapport à S. Dans l'équation

de réaction présentée ci-dessus, on a choisi un cas de réaction enzymatique très classique à 2 substrats et

2 produits. R désigne le 2° substrat de l'enzyme que l'on apporte dans le milieu réactionnel et P et Q les

produits de la réaction enzymatique. Si P ou Q possèdent une absorbance spécifique forte à une longueur

d'onde donnée, on va pouvoir doser S grâce à la réaction catalysée par Ez.

2. Présentation de la mesure d'une concentration en glucose par méthode à la glucose

oxydase

On va illustrer les propos théoriques présentés ci-dessus par un exemple pratique : la mesure d'une

concentration en glucose par méthode enzymatique au point final de la réaction.

2.1 La réaction principale du dosage.

En présence de dioxygène en excès (et pour ça on a tout l'O2 atmosphérique à disposition !), la

glucose oxydase (GOD) catalyse très spécifiquement la réaction totale : glucose + O2 bbbr gluconolactone + H2O2 Dans la foulée, la gluconolactone réagit avec l'eau pour donner de l'acide gluconique : gluconolactone + H2O bbbr acide gluconique (réaction totale)

2.2 Doser H2O2 formé grâce à une réaction enzymatique couplée et par lecture photométrique

Ni l'acide gluconique, ni H2O2 ne possèdent d'absorbance caractéristique mesurable. Afin d'obtenir

un produit mesurable par absorptiométrie UV-visible, on va mettre en oeuvre une deuxième réaction

enzymatique totale qui consommera H2O2 et qui conduira à un composé mesurable par photométrie

d'absorption moléculaire. On dit en biochimie qu'il y a une réaction couplée utilisée comme réaction

indicatrice.

Cette réaction indicatrice est catalysée par l'enzyme peroxydase (POD) et est représentable par :

2 H2O2 + phénol (excès) + amino-4-antipyrine (excès) ------------> quinoéimine( composé coloré 505

nm) + 4 H2O

Le bilan des réactions couplées est :

2 glucose + 2 O2 + 2 H2O + phénol + 4 amino-4-antipyrine -----> acide gluconique + quinoéimine

La quinoéimine, à complétude de réaction, est dosée par absorptiométrie moléculaire à 505

nm. A la fin des deux réactions couplées, on se trouve ramené à un classique dosage de

substance à l'aide d'une révélation colorée par des réactifs apportés en excès et réaction totale. Et

ça, on connaît bien.

2.3 Étalonnage du dosage du glucose par la méthode enzymatique à la GOD, réalisation

d'une gamme d'étalonnage classique

On va utiliser un kit de dosage qui fournit un réactif R contenant les 2 enzymes GOD et POD et les

\analyschim\doseS-Ez-pointfinal JF Perrin maj 2017 page 2/ 4 substrats phénol et amino-4-antipyrine en solution dans un tampon adapté. Compléter le tableau d'étalonnage ci-dessous (à reporter dans le compte-rendu) :

TR (témoin

réactifs)1234

Étalon glucoseà 0,4 g/L

20 µLà 1 g/L

20 µLà 2 g/L

20 µLà 4 g/L

20 µL

eau20 µL---- Réactif R2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL

Quantité de

glucose par tube

Absorbances

contre le TRHomogénéiser. Mesurer les absorbances à 505 nm contre le TR quand la réaction est

terminée. Il faut 10 minutes à 37°C et 20 minutes à 20°C. Etablir l'étalonnage absorbance contre TR en fonction de la quantité de glucose par tube réactionnel.

La méthode est linéaire jusqu'à 4 g/L.

Compte-rendu : sous le tableau d'étalonnage qui aura été reporté et complété dans le compte-rendu,

proposer l'allure théorique de tracé du graphe d'étalonnage.

2.4 Étalonnage du dosage du glucose par la méthode enzymatique à la GOD, étalonnage en 2

points, le témoin réactif et un unique étalon

Comme le réactif R est onéreux, on décide d'étalonner sur 2 points seulement, un témoin réactif TR

et un étalon à 2,5 g/L

TRétalon

Étalon glucose

à 2,5 g/L20 µL

eau20 µL-

Réactif R2000 µL2000 µL

Absorbances

contre le TRHomogénéiser. Mesurer l'absorbance de l'étalon à 505 nm contre le TR quand la réaction est terminée. Il faut 10 minutes à 37°C et 20 minutes à 20°C.

La méthode est linéaire jusqu'à 4 g/L.

Compte-rendu : proposer un graphe représentant cet étalonnage 2 points.

2.5 Problèmes d'interférents

La GOD est spécifique du glucose. Malheureusement, la réaction indicatrice catalysée par la POD

est une source éventuelle de problèmes :

La présence de catalase dans un échantillon conduirait à la réaction : H2O2 + H2O2 ------> 2 H2O + O2

Des molécules à fonction thiol (R-SH) et l'acide ascorbique (vitamine C) sont capables de réduire H2O2 en

H2O. (Voir par exemple https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00435559/document)

Cet ensemble de réactions conduit potentiellement à une erreur de mesure par défaut puisqu'une

partie de H2O2 formé par l'action de la GOD sur le glucose ne serait alors pas transformée en composé

coloré dosé. \analyschim\doseS-Ez-pointfinal JF Perrin maj 2017 page 3/ 4

3. Travail pratique

4 échantillons sont à doser.

•Un échantillon Ech.1 dosable de façon simple car de concentration attendue inférieure à 4

g/L. •Un échantillon Ech. 2 qui est une solution contenant le seul sucre saccharose et de concentration annoncée entre 100 et 300 g/L (0,292 à 0,877 M). Pour la doser, on décide de la diluer au 1/100 exactement et d'hydrolyser le saccharose en glucose et fructose par ajout d'invertase. Ech. 2 sera dilué au 1/100 en en tampon d'hydrolyse ph 4,5, en fiole jaugée de

100 mL et avec une pipette jaugée de 1mL deux traits de classe A. Lors de la dilution 600

µL d'invertase à 1000 U/mL sont ajoutés, l'hydrolyse est conduite 30 minutes à 35°C. On

obtient ainsi Ech.2 1/100 inverti.

•Echantillon I1, c'est une solution test de composition exacte connue, glucoe 1g/L + vit c 0,2 g/L .

•Echantillon I2, c'est une solution test de composition exacte connue, glucose 1g/L + cystéine 0,2

g/L en tampon acide acétique/acétate de Na+ 0,05 mol/L pH 4,75

•Echantillon I3, c'est une solution test de composition exacte connue, glucose 1g/L + cystéine 0,2

g/L en tampon glycine/NaOH 0,05 mol/L pH 8,6.

TREtalon Ech.1 Ech. 2 1/100

inverti I1I2I3

Étalon

glucose

à 2,5 g/L-

20 µL-----

eau20 µL------

Ech1--20 µL----

Ech2 au

1/100 et

hydrolysé---20 µL---

I1----20 µL

I2-----20 µL

I3------20 µL

Réactif R2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL2000 µL Traiter tous les tubes en même temps. Homogénéiser. Mesurer les absorbances à 505 nm contre de l'eau quand la réaction est terminée. Il faut 10 minutes à 37°C et 20 minutes à 20°C.

Absorbances

contre l'eau

Absorbances

contre le TR

A partir des résultats expérimentaux, sachant qu'aucun témoin de compensation échantillon n'est

nécessaire car les échantillons ne possèdent aucune absorbance propre à 505 nm, calculer la

concentration en glucose des échantillons Ech1, I1 et I2. Commenter les résultats de I1 et I2 et I3. Calculer

la concentration en saccharose de Ech.2. \analyschim\doseS-Ez-pointfinal JF Perrin maj 2017 page 4/ 4

Question annexe. Sachant qu'une unité d'invertase catalyse l'hydrolyse de 1 µmol de saccharose par

minute à pH 4,5 et à 55°C et que l'activité est divisée par 4 entre 35°C et 55 °C, montrer que les opérations

d'hydrolyse permettent bien d'hydrolyser en glucose et fructose la totalité du saccharose de la fiole jaugée.

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