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THESE

Pour obtenir le diplôme de doctorat

Spécialité Aspects cellulaires et moléculaires de la biologie

Aspects vasculaires -NMDA : implications dans le

Présentée et soutenue par

Antoine ANFRAY

Thèse dirigée par Cyrille ORSET, laboratoire INSERM U1237, PhIND

Thèse soutenue publiquement le 12 / 12 / 2017

devant le jury composé de Dr Serge CHARPAK Directeur de Recherche, Université

Paris Descartes Rapporteur

Pr Emmanuelle CANET-SOULAS Professeur des universités, Université

Claude Bernard Lyon 1 Rapporteur

Dr Anne JOUTEL Directeur de Recherche, Université

Paris Diderot Examinateur

Pr Omar TOUZANI Professeur des université, Université de

Caen Normandie Examinateur

Pr Denis VIVIEN Professeur des université, Université de

Caen Normandie Examinateur

Dr Cyrille ORSET Maître de conférences HDR, Université de Caen Normandie Directeur de thèse

REMERCIEMENTS

SRXUPHQHUPHVWUDYDX[GHWKqVH

SDUWLHGHPRQMXU\GHWKqVH

+HH&KRTXLIXWPRQSUHPLHUHQFDGUDQWjPRQ

GHFHVFLQTDQQpHV

GHSUqVRXGHORLQODUpDOLVDWLRQGHPDWKqVH

HWDFFRPSDJQDWHXUGHFDIp

1

AVANT-PROPOS

Physiopathology and Imaging of

Neurological Disorders » (PhIND) dirigée par le Professeur Denis Vivien. Historiquement, le

thème de recherche de cette unité concerne les sérines protéases, et plus particulièrement

cérébrale. Cependant, les effets du tPA ne se limitent pas à la fibrinolyse. Ainsi, le tPA est

également présent dans le parenchyme cérébral, où il peut avoir des rôles variés, comme dans

la mémoire ou le couplage neurovasculaire. Au-delà de ses effets physiologiques, le tPA a au moins un point commun -Methyl-D-Aspartate.

Le lab

bénéfiques tout en supprimant ses effets délétères. NMDA et ses conséquences dans deux contextes différents couplage neurovasculaire (étude 1), à une ischémie cérébrale (étude 2). Anisi, pour présenter ces travaux de thèse, je commencerai principal interlocuteur dans ces travaux, le récepteur NMDA. Enfin je présenterai les deux contextes dans lequel leur interaction a été étudiée cérébrale. 2 3

pour sa capacité à convertir le plasminogène en plasmine, une enzyme capable de dégrader les chaînes de fibrine

des caillots sanguins. Pour cette fonction pro-fibrinolytique, le tPA est le seul traitement pharmacologique

présente plusieurs limites. Outre son rôle dans la fibrinolyse, le tPA est aussi capable de moduler différents

fonctions du tPA impliquent son interaction avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate (NMDA), qui permet de

potentialiser leur signalisation. Sur le plan structurel, deux formes du tPA ont été identifiées : une forme simple

chaîne (sc-tPA) et une forme double chaîne (tc-tPA). Ces deux formes, dont les proportions peuvent varier dans la

solution administrée aux patients pour la thrombolyse post-AVC ischémique, partagent certaines fonctions

communes mais peuvent aussi avoir des actions différentes. Le premier objectif de nos travaux visait à mieux

énergétique des neurones. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux effets des formes sc-tPA et

tc-tPA utilisées lors de

Premièrement, nos résultats mettent e

fonctionnelle dans le cadre du couplage neurovasculaire. En effet, nous montrons chez la souris que le tPA

vasculaire peut interagir avec les récepteurs NMDA présents à la surface des cellules endothéliales des artères et

ont des effets différents et parfois opposés. Le sc-

récupération fonctionnelle, alors que le tc-tPA est moins efficace pour réduire la lésion et ne diminue pas les

déficits fonctionnels. De fait, nos données montrent que le tc- hématoencéphalique par rapport au sc-

importants. Nos travaux soulignent également la nécessité de prendre en compte les différences entre les formes

eutiques impliquant cette molécule. Mots clés : tPA, récepteurs NMDA, couplage neurovasculaire, AVC, fibrinolyse

Summary

The tissue-type plasminogen activator (tPA) is a serine protease initially discovered in the blood for its

ability to convert plasminogen into plasmin, an enzyme capable of degrading fibrin chains of blood clots. tPA is

the only pharmacological treatment currently used for the acute phase of ischemic stroke, although it has several

limitations. Besides its role in fibrinolysis, tPA also modulates various physiological and pathological phenomena

within the central nervous system and neurovascular unit, such as memory, excitotoxicity and neurovascular

coupling, which has been described recently. Several functions of tPA involve its interaction with N-Methyl-D-

Aspartate (NMDA) receptors, which leads to an increase in NMDA signaling. Structurally, two forms of tPA have

been identified: a single chain form (sc-tPA) and a double chain form (tc-tPA). These two forms, whose

proportions vary in the solution administered for thrombolysis during ischemic stroke, share some common

functions but may also differ in their therapeutic action. The first objective of our work was to better understand

the implication of tPA in neurovascular coupling, which is an essential phenomenon for cerebral functioning that

allows active brain regions to benefit from increased blood supply in order to meet local energy demands. In the

second part of our work, we investigated the effects of sc-tPA and tc-tPA in a murine model of ischemic

thromboembolic stroke.

Our results establish a role for vascular tPA in increasing functional hyperemia in neurovascular coupling.

We show that vascular tPA interacts with NMDA receptors present at the surface of endothelial cells of arteries

and arterioles to increase their dilation during neuronal activity. In the context of cerebral ischemia, our results

indicate that when administered during early thrombolysis, sc-tPA and tc-tPA have different and sometimes

opposite effects. tc-tPA is less effective than sc-tPA in reducing lesion volume and protecting against functional

impairment. In fact, our data show that tc-tPA worsens the integrity of the blood-brain barrier compared to sc-tPA.

Overall, these data improve our knowledge of the mechanisms of action of tPA in important physiological and

pathological phenomena. Our work underlines the need to take into account differences between sc-tPA and tc-

tPA when trying to improve the current treatment for stroke and in the development of future therapeutic strategies

involving this molecule. Key words: tPA, NMDA receptors, neurovascular coupling, fibrinolysis

Resumé

Resumé

Resumé

Resumé

4 5

SOMMAIRE

Avant-propos .......................................................................................................................... 1

Sommaire ............................................................................................................................... 5

Index des figures et tableaux .................................................................................................. 9

Liste des abréviations ........................................................................................................... 12

Introduction ................................................................................................................ 15

1. tissulaire du plasminogène .................................................................... 17

1.1. Historique ........................................................................................................................... 17

1.2. Structure du tPA ................................................................................................................. 19

1.3. Expression du tPA .............................................................................................................. 21

1.3.1. Expression du tPA dans la circulation .......................................................................... 21

1.3.1.1. Synthèse et libération par les cellules endothéliales .............................................. 21

1.3.1.2. Clairance du tPA circulant .................................................................................... 23

1.3.2. Expression périphérique du tPA ................................................................................... 23

1.3.3. Expression du tPA dans le système nerveux central ..................................................... 23

1.4. Inhibition du tPA : les serpines .......................................................................................... 25

1.4.1. PAI-1 ............................................................................................................................ 26

1.4.2. Neuroserpine ................................................................................................................ 27

1.5. Fonctions du tPA ................................................................................................................ 27

1.5.1. Le tPA dans la circulation ............................................................................................ 27

1.5.1.1. Fibrinolyse ............................................................................................................ 27

1.5.1.2. tPA et barrière hémato-encéphalique .................................................................... 29

1.5.2. Le tPA dans le système nerveux central ....................................................................... 31

1.5.2.1. Le tPA comme neuromodulateur .......................................................................... 31

1.5.2.2. Développement et migration cellulaire ................................................................. 31

1.5.2.3. Plasticité synaptique .............................................................................................. 32

1.5.2.4. tPA et comportement............................................................................................. 33

1.5.2.5. tPA et apoptose ..................................................................................................... 34

1.5.2.6. tPA et substance blanche ....................................................................................... 34

1.5.2.7. ........................................................................ 35

1.5.2.8. tPA et inflammation .............................................................................................. 37

2. Les récepteurs NMDA ............................................................................................... 39

2.1. Historique - le système glutamatergique ............................................................................ 39

2.2. Structure des récepteurs NMDA ........................................................................................ 41

2.2.1. Les différentes sous-unités ........................................................................................... 41

2.2.2. Composition en sous-unités .......................................................................................... 43

2.3. Caractéristiques des récepteurs NMDA ............................................................................. 44

2.3.1. Propriétés pharmacologiques ........................................................................................ 44

2.3.1.1. Réponse aux molécules endogènes ....................................................................... 44

6

2.3.1.2. Réponse aux molécules exogènes ......................................................................... 45

2.3.2. Localisation cellulaire des récepteurs NMDA .............................................................. 45

2.4. Rôles des récepteurs NMDA .............................................................................................. 47

2.4.1. Maturation synaptique .................................................................................................. 47

2.4.2. Plasticité synaptique : LTP et LTD .............................................................................. 47

2.4.3. Apoptose ....................................................................................................................... 48

2.4.4. Excitotoxicité ................................................................................................................ 48

2.4.5. Récepteurs NMDA et tPA ............................................................................................ 49

2.4.6. Les récepteurs NMDA des cellules endothéliales ........................................................ 51

3. Le couplage neurovasculaire ..................................................................................... 53

3.1. Historique ........................................................................................................................... 53

3.2. La perfusion cérébrale est primordiale pour le fonctionnement normal du SNC ............... 54

3.2.1. Le SNC exerce un contrôle actif sur le DSC ................................................................ 54

3.2.2. ................................................................................................ 55

3.3. ............................................................ 57

3.3.1. Voies de signalisation ................................................................................................... 57

3.3.1.1. Voie de signalisation neuronale ............................................................................ 58

3.3.1.2. Voies de signalisation astrocytaires ...................................................................... 59

3.3.1.3. Cellules endothéliales et tonus vasculaire ............................................................. 61

3.3.2. Agents vasodilatateurs : NO, adénosine, lactate et O2, ................................................. 63

3.4. Conséquences vasculaires du couplage neurovasculaire .................................................... 64

3.4.1. Capillaire vs artériole .................................................................................................... 64

3.4.2. Relaxation des cellules musculaires lisses .................................................................... 65

3.4.3. Relaxation des péricytes ............................................................................................... 66

3.5. Facteurs influençant le couplage neurovasculaire .............................................................. 67

3.5.1. tPA et tonus vasculaire ................................................................................................. 67

3.5.2. Autres facteurs influençant le couplage neurovasculaire .............................................. 69

3.6. Imagerie BOLD .................................................................................................................. 70

3.7. Couplage neurovasculaire et pathologie ............................................................................. 71

3.7.1. Couplage neurovasculaire et dépression corticale ........................................................ 71

3.7.2. ...................................................... 71

3.7.3. Couplage neurovasculaire et hypertension ................................................................... 72

3.7.4. Couplage neurovasculaire et ischémie cérébrale .......................................................... 72

4. ................................................................................... 75

4.1. ........................................................................................................ 76

4.1.1. Epidémiologie .............................................................................................................. 76

4.1.2. ............................................................................. 76

4.1.3. ....................................................................... 76

4.1.4. ........................................................................................ 76

4.1.4.1. Facteurs de risques non modifiables ..................................................................... 77

4.1.4.2. Facteurs de risque modifiables .............................................................................. 77

4.2. ............................................................................ 77

7

4.2.1. Formation du caillot ..................................................................................................... 77

4.2.1.1. Voie dépendante du collagène............................................................................... 78

4.2.1.2. Voie dépendante du facteur tissulaire ................................................................... 78

4.2.2. Expansion du thrombus et fibrinolyse .......................................................................... 79

4.3. .............................................................................. 79

4.3.1. Formation et expansion de la lésion ............................................................................. 79

4.3.2. Les mécanismes cellulaires .......................................................................................... 81

4.3.3. .................................................................................................................... 82

4.3.4. ............................................................................................................. 83

4.4. ................................................................................. 84

4.4.1. La thrombolyse pharmacologique ................................................................................ 84

4.4.2. tPA simple et double chaîne ......................................................................................... 85

4.4.3. ........................................................................................................ 86

Objectifs ....................................................................................................................... 89

Objectifs ............................................................................................................................... 91

Résultats ...................................................................................................................... 93

1. Les récepteurs NMDA endothéliaux participent au couplage neurovasculaire : un

mécanisme médié par le glutamate et le tPA circulant. ................................................... 95

1.1. ....................................................................................................... 96

1.2. Matériels et méthodes ........................................................................................................ 98

1.3. Résultats ........................................................................................................................... 105

2. La thrombolyse par le tPA simple chaîne ou le tPA double chaîne a des conséquences

différentes sur les déficits après une ischémie cérébrale chez la souris. ........................ 125

2.1. ..................................................................................................... 126

2.2. Matériels et Méthodes ...................................................................................................... 127

2.3. Résultats ........................................................................................................................... 132

Discussion .................................................................................................................. 139

1. Le tPA vasculaire est impliqué dans le couplage neurovasculaire .......................... 141

1.1. ? ....................... 141

1.1.1. Les cellules endothéliales peuvent libérer du tPA en réponse à un stimulus extérieur 141

1.1.2. .......................................................... 142

1.1.3. 2+............................. 143

1.1.4. Modification du shear stress ...................................................................................... 144

1.1.5. Le tPA : un rôle de maintien de la relaxation vasculaire ? ......................................... 144

1.1.6. .......... 145

1.1.7. Sc-tPA et tc-tPA : différents effets sur le couplage neurovasculaire ? ....................... 146

1.2. Le tPA libéré dans la circulation augmente la dilatation des vaisseaux ........................... 146

1.2.1. Modèle expérimental .................................................................................................. 146

1.2.2.

.................................................................................................................................... 147

1.2.3. Le tPA vasculaire induit une augmentation de la réponse vasculaire ......................... 147

8

1.2.4. Le tPA vasculaire agit sur les récepteurs NMDA présents sur les cellules endothéliales.

.................................................................................................................................... 148

1.3. ................................................................ 150

1.3.1. Le tPA active la vasodilatation ................................................................................... 150

1.3.2. Activation des récepteurs NMDA par le tPA : quelles conséquences ? ..................... 151

1.4. Quel rôle pour le tPA vasculaire dans le couplage neurovasculaire ? .............................. 154

1.5. Implication de la voie du tPA vasculaire dans le couplage neurovasculaire .................... 154

1.5.1. tPA et vieillissement ................................................................................................... 154

1.5.2. ....................................................................................... 155

1.5.3. tPA et ischémie cérébrale ........................................................................................... 155

2. Effets différentiels du sc-tPA et du tc-tPA lors de la thrombolyse. ......................... 157

2.1. ........................................................ 157

2.2. .................................................................................... 157

2.2.1. ...................................................................................................... 157

2.2.2. ....................................................................................... 158

2.2.3. Les formes de tPA utilisées pour la thrombolyse ....................................................... 159

.......................................................................................................................................... 159

2.3.1. Effets des différentes formes du tPA sur la reperfusion ............................................. 159

2.3.2. Le sc-tPA est efficace pour lyser le caillot et réduire les déficits ............................... 159

2.3.3. Le tc- ............................................. 161

2.3.4. Evaluation des déficits moteurs après la thrombolyse ................................................ 163

2.4. Stratégies développées pour améliorer le traitement des AVC ischémiques .................... 164

2.4.1. ............................... 164

2.4.2. Comment améliorer la prise en charge aigue des AVC ischémiques ?....................... 164

Conclusion générale .................................................................................................. 167

Annexe 1 .................................................................................................................. 1679

Autres travaux .......................................................................................................... 175

1.1. Distant space processing is controlled by tPA-dependent NMDA Receptor signaling in

the entorhinal cortex. ................................................................................................. 178

1.2. Hyperfibrinolysis increases bloodbrain barrier permeability by a plasmin- and

bradykinin-dependent mechanism. ............................................................................ 192

1.3. Recombinant ADAMTS-4 enhances tPA-mediated fibrinolysis in ischemic stroke. ....

................................................................................................................................. 232

Bibliographie ............................................................................................................. 249

9

INDEX DES FIGURES ET TABLEAUX

Figure 1 ೀ ................................................................................................................ 17

Figure 2 I

.................................................................................................... 19

Figure 3 I Structure et fonctions du tPA, sous forme simple et double chaîne. ...................................... 21

Figure 4 I shear stress » laminaire de 25 dynes/cm2 sur la sécrétion de tPA par des cellules

endothéliales ........................................................................................................................................... 22

Figure 5 I Clairance hépatique du tPA. .................................................................................................. 23

Figure 6 I Localisation du tPA au sein du système nerveux central chez la souris ................................ 24

Figure 7 I Expression du tPA au sein de différentes cellules du SNC chez la souris adulte .................. 25

Figure 8 I . ................................................................................ 26

Figure 9 I Mécanisme de la fibrinolyse endogène .................................................................................. 28

Figure 10 I Barrière hématoencéphalique............................................................................................... 29

Figure 11 I Effet du tPA sur la barrière hématoencéphalique ................................................................ 30

Figure 12 I .......................................................... 32

Figure 13 I

.............................................................................................................................................................................. 33

Figure 14 I Les souris tPA KO sont résistantes à la morte neuronale excitotoxique .............................. 35

Figure 15 I Des souris déficientes en tPA présentent un volume de lésion réduit après une ischémie

cérébrale .................................................................................................................................................. 37

Figure 16 I Classification des récepteurs au glutamate .......................................................................... 41

Figure 17 I Expression (ARNm) des sous unités GluN1 et GluN2 des récepteurs NMDA dans le cerveau

de rat au cours du développement. .......................................................................................................... 42

Figure 18 I ......................................................................................... 43

Figure 19 I La synapse glutamatergique ................................................................................................. 46

Figure 20 I La sous-unité GluN1 des récepteurs NMDA est exprimée dans les cellules endothéliales

cérébrales de souris. ................................................................................................................................ 47

Figure 21 I -unité GluN1 des récepteurs NMDA potentialise la

e Ca2+ .............................................................................................................. 50

Figure 23 I Etude du volume du cerveau et des pieds chez Mr. Cane en réponse à un stimulus émotionnel

.............................................................................................................................................................................. 53

Figure 24 I Modélisation de la vascularisation cérébrale à la surface du cortex somatosensoriel des

vibrisses. ................................................................................................................................................. 55

Figure 25 I ...................................................................................................... 56

Figure 26 I Principales voies par lesquelles le glutamate régule le DSC. .............................................. 58

10

Figure 27 I Figure

.............................................................................................................................................................................. 59

Figure 28 I 2+ intracellulaire dans les astrocytes in

vivo, via une activation des mGluR. ........................................................................................................ 60

Figure 29 I -sérine sur des artères isolées de souris requiert

un endothélium intact et la présence de eNOS ........................................................................................ 62

Figure 30 I Figure ....................................... 63

Figure 31 I Une stimulation électrique induit une contraction locale dépendante du Ca2+ de péricytes de

la rétine de rat. ......................................................................................................................................... 67

Figure 32 I Effet du tPA sur le couplage neurovasculaire ...................................................................... 69

Figure 33 I .......................................................... 70 Figure 34 I ........................................................... 75

Figure 35 I Initiatio ............................................................................. 77

Figure 37 I ................................................................................. 80 Figure 38 I Evolution spatio- .............................. 81

Figure 39 I

.............................................................................................................................................................................. 81

Figure 40 I ................... 82

Figure 41 I ................................... 84

Figure 42 I Effets du sc-tPA et du tc- ................................................................ 86

Figure 43 I Modèle expérimental et paramètres physiologiques mesurés .............................................. 99

Figure 44 I Séquence de stimulation lors de la mesure du DSC ........................................................... 100

Figure 45 I Traitement des images obtenues par laser Doppler speckle ............................................... 100

Figure 46 I Figure : Construction du plasmide pLIVE et transfection hydrodynamique ..................... 102

Figure 47 I Le signal mesuré en laser Doppler speckle est plus intense lorsque le crâne est affiné chez la

souris. .................................................................................................................................................... 106

Figure 48 I les souris tPA [-/-] ....................................... 107 Figure 49 I nctionnelle chez les souris tPA [-/-]............ 109

Figure 50 I

............................................................................................................................................................................ 111

Figure 51 I

fonctionnelle chez les souris tPA [-/-] ................................................................................................... 112

Figure 52 I

Figure 53 I

par le tPA. ............................................................................................................................................. 116

Figure 54 I Le tPA vas

vasculaire (en cours) ............................................................................................................................. 118

11

Figure 55 I Le tPA vasculaire augmente la dilatation des vaisseaux de plus gros diamètre ................. 119

Figure 56 I Les récepteurs NMDA sont préférentiellement exprimés par les cellules endothéliales des

artères et artérioles (En cours) ............................................................................................................... 122

Figure 57 I

voie RhoA ............................................................................................................................................. 123

Figure 58 I .................................................... 129

Figure 59 I Caractérisation de la production de sc-tPA et de tc-tPA. ................................................... 133

Figure 60 I Protocole expérimental ...................................................................................................... 134

Figure 61 I La thrombolyse au tPA augmente la reperfusion et tend à réduire les volumes de lésion à 24h

............................................................................................................................................................................ 135

Figure 62 I Le sc-tPA est plus efficace que le tc-tPA pour promouvoir la reperfusion et diminuer le ....................................................................................... 136 Figure 63 I La thrombolyse par le sc-tPA diminue les déficit ............. 137 Figure 64 I Le tc- ...................................... 138

Figure 65 I Régulation de la réactivité vasculaire par les cellules localisées dans les régions sous-

corticales et corticales. .......................................................................................................................... 142

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