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Du fait de la proportionnalité entre la concentration de la solution placée dans la cuve spectrophotométrique et l'absorbance lue par le spectrophotomètre

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concentration c (en mol/l) dans le spectrophotomètre Io l'intensité de lumière transmise à travers le solvant pur On définit alors l'absorbance A par :

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Notions et contenus Absorbance spectre d'absorption couleur d'une espèce molécule dont la formule topologique est donnée ci-dessous

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On rappelle les différentes formules intervenant dans la détermination de La courbe d'étalonnage de l'absorbance en fonction de la concentration molaire

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Si on veut calculer la concentration alors la formule est C La loi de Beer-Lambert est une relation entre l'absorbance d'une solution

Absorbance vs Concentration - Beer’s Law Explained Absorbance vs

The Beer-Lambert law relates the absorbance to the concentration: A=?bc where A is absorbance (no units since A = log 10 P 0 / P) ?is the molar absorbtivity or extinction coefficient with units of L mol-1 cm-1 b is the path length of the sample – i e the path length of the cuvette in which the sample

131 Measuring Absorption - Purdue University

Measuring Concentration 13 1 : 8/10 Performance can be estimated from Beer's Law Assume that an absorbance of 0 01 will provide a satisfactory signal-to-noise ratio An optimistic estimate: assume ?= 105 and l = 10 cm 8 5 0 01 10 M 10 10 A C ?l == =? × A realistic estimate: assume ?= 104 and l = 1 cm 5 4 0 01 10 M 10 1 A C ?l == =? ×

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If we used the Absorbance at 605nm and used Beer™s Law to determine Compound B using ( B605nm = 0 0700 L mmoles-1 cm-1) A = bc 0 700 = (0 070 L mmole-1 cm-1) * (1cm) * (c) c = 10 00 mM = 10 0 mM We could determine the concentration of B at 605nm with B605nm alone because Compound A does not absorb at 605 nm ( A605nm = 0 000 L mmoles

What is the formula for calculating absorbance concentration?

According to Beer’s Law, A = ?Lc, a substance’s concentration and absorbance are directly proportional under ideal conditions: a high-concentration solution absorbs more light. In comparison, a low-concentration solution absorbs less light.

What is the relationship between absorbance and concentration?

Absorption means that a substance captures and transforms energy while concentration refers to the amount of a substance in a defined space. If the concentration of solution is increased, then there are more molecules for the light to hit when it passes through.

How is absorbance at 280 nm used to measure protein concentration?

Protein concentration can be measured directly, via absorbance at 280 nm in a UV spectrophotometer, or indirectly, using colorimetric methods such as BCA or Bradford assays. Here are a few application notes on protein quantitation you may find of interest:

How is the length of the light path related to absorbance concentration?

As a result, the concentration and absorbance are directly proportional. The length of the path (b) is a second consideration. The longer the path length, the more molecules in the path of the radiation beam, and thus the absorbance increases. As a result, the length of the path is proportional to the concentration.

1. Rappels

Du fait de la proportionnalité entre la concentration de la solution placée dans la cuve spectrophotométrique et l"absorbance lue par le spectrophotomètre, lorsqu"on trace la courbe Abs = f(conc), l"Absorbance en fonction de la concentration de la substance, on obtient une droite d"équation y = ax + b où : y = ax + b

Pour notre étude, on peut donc remplacer

y = ax + b par Abs = a Conc + b

Spectrophotométrie et loi de Beer-Lambert

les valeurs y sont placées en ordonnée.

Ici, elles

correspondent

à l"absorbance

(pas d"unité) a est la pente de la droite.

Elle donne une

droite plus ou moins pentue

Les valeurs x

sont placées en abscisse.

Ici, elles

correspondent à la concentration de la solution dans la cuve b est l"ordonnée

à l"origine qui

est nulle du fait de faire le blanc réactif

2. Loi de Beer lambert

La loi de Beer Lambert précise l"existence d"une proportionnalité entre la concentration de la molécule dosée, son absorbance à une certaine longueur d"onde ET la largeur de la cuve utilisée pour le dosage. l"équation de droite Abs = a Conc + b est donc adaptée pour faire apparaître dans l"équation la largeur de la cuve

Abs = a Conc + b

Abs = ε x l x Conc

■ b, l"ordonnée à l"origine, disparaît de l"équation car considéré comme nulle

■ a , la pente, est décomposée en ε x l où : ε est appelé coefficient d"extinction molaire ou coefficient d"absorption molaire de la molécule dosée. il s"agit d"une valeur constante spécifique à chaque substance.

ε est une lettre grecque lue "epsilon")

l est le trajet optique du faisceau à travers la solution (exprimé en cm) Il s"agit plus simplement de la largeur de la cuve qui est généralement de 1 cm → En connaissant l"Abs, ε et l, on peut déterminer la concentration de la solution à doser

Abs = ε x l x Conc

devient

Conc = Abs / (ε x l)

3. Exercices

Exercices 1 : Détermination de l"unité du coefficient d"extinction molaire Abs =

ε x l x conc

Dans cette égalité, l"unité de l est le cm et celle de la concentration est la mol.L -1.

L"abs n"a pas d"unité.

Q1. Déterminer l"unité d"

Abs = ε x l x conc

Du coup on modifie l"égalité pour se retrouver avec ε seul et on obtient : Abs l x conc → L"unité d"ε est donc : L.mol-1.cm-1 sans unités

On cherche

justement cette unité unité : cm unité : mol.L-1 sans unités unité : cm-1 car on divise des cm unité : L.mol-1 car diviser des mol.L-1 revient à la même chose que multiplier par des L.mol -1 Exercice 2 L"absorbance d"une solution de sulfate de cuivre (CuSO

4) obtenue à une largeur d"onde de

810nm est de 0,700. Le dosage est réalisé à l"aide de cuves spectrophotométriques de 1

cm de largeur. Q2. Déterminer la concentration d"une solution de sulfate de cuivre Donnée : le coefficient d"extinction molaire du sulfate de cuivre à cette largeur d"onde est

ε = 10 L.mol-1.cm-1

Q3. Quelle sera l"absorbance à 810nm d"une solution de 3,5 mmol.L-1 de sulfate de cuivre ?

Abs = ε x l x conc

Abs = 10 x 1 x 3,5 10

-3

Abs = 0,035

Q4. Quelle sera l"absorbance à 540nm d"une solution de 3,5 mmol.L-1 de sulfate de cuivre ? On ne peut pas répondre à cette question car nous n"avons comme donné que le coefficient d"extinction molaire du sulfate de cuivre à 810nm mais pas à 540nm ! J"ai fait cette question pour que vous vous rappeliez que le coefficient d"extinction molaire est donné pour une longueur d"onde précise. Exercice 3 Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est le coenzyme de nombreuses déshydrogénases. Q5. Calculer l"absorbance à 340 nm et à 260 nm d"une solution de NADH à 0,05 g.L-1, placée dans une cuve dont le trajet optique est de 1 cm.

Données :

La masse moléculaire du NADH est : M = 709 g.mol -1

ε NADH (à 340 nm) = 6 220 L . mol-1 . cm-1

ε NADH (à 260 nm) = 15 400 L . mol-1 . cm-1

L"unité de concentration de la solution est le g.L-1 alors que ε est exprimé en L. mol-1 .cm-1 Il faut donc convertir l"unité de concentration de la solution de NADH de g.L -1 en mol.L-1 Pour cela, on connaît la formule Cm = C x M

Equation aux grandeurs : Cm = C x M

→ C = Cm / M

Equations aux unités : mol.L

-1 = g.L-1 / g.mol-1 Equations aux valeurs numériques : C = 0,05 / 709

Résultat avec unités : C = 7,05 10

-5 mol.L-1

Le calcul de l"absorbance est alors possible :

A 340nm : Abs = ε x l x conc

Abs = 6220 x 1 x 7,05 10

-5

Abs = 0,439

A 260nm : Abs =

ε x l x conc

Abs = 15400 x 1 x 7,05 10

-5

Abs = 1,086

Q6. A l"aide des résultats obtenus, remplir le tableau ci-dessous :

Longueur d"onde (nm) 340 260

ε (L .mol-1 .cm-1) 6220 15400

Conc (mol.L-1) 7,05 10-5 7,05 10-5

L (cm) 1 1

Abs 0,439 1,086

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What is the formula for calculating absorbance concentration?

What is the relationship between absorbance and concentration?

How is absorbance at 280 nm used to measure protein concentration?

How is the length of the light path related to absorbance concentration?

1. Rappels

Pour notre étude, on peut donc remplacer

Spectrophotométrie et loi de Beer-Lambert

Ici, elles

à l"absorbance

Elle donne une

Les valeurs x

Ici, elles

à l"origine qui

2. Loi de Beer lambert

Abs = a Conc + b

Abs = ε x l x Conc

ε est une lettre grecque lue "epsilon")

Abs = ε x l x Conc

Conc = Abs / (ε x l)

3. Exercices

ε x l x conc

L"abs n"a pas d"unité.

Q1. Déterminer l"unité d"

Abs = ε x l x conc

On cherche

4) obtenue à une largeur d"onde de

810nm est de 0,700. Le dosage est réalisé à l"aide de cuves spectrophotométriques de 1

ε = 10 L.mol-1.cm-1

Abs = ε x l x conc

Abs = 10 x 1 x 3,5 10

Abs = 0,035

Données :

ε NADH (à 340 nm) = 6 220 L . mol-1 . cm-1

ε NADH (à 260 nm) = 15 400 L . mol-1 . cm-1

Equation aux grandeurs : Cm = C x M

Equations aux unités : mol.L

Résultat avec unités : C = 7,05 10

Le calcul de l"absorbance est alors possible :

A 340nm : Abs = ε x l x conc

Abs = 6220 x 1 x 7,05 10

Abs = 0,439

A 260nm : Abs =

ε x l x conc

Abs = 15400 x 1 x 7,05 10

Abs = 1,086

Longueur d"onde (nm) 340 260

ε (L .mol-1 .cm-1) 6220 15400

Conc (mol.L-1) 7,05 10-5 7,05 10-5

L (cm) 1 1

Abs 0,439 1,086