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Schéma d'un appareil à chromatographie en phase liquide. A. POMPES. Le dégazage de la phase mobile est une opération obligatoire en chromatographie phase.
chapitre ii: chromatographie liquide haute performance (hp
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HPLC Principe et appareillage
20 jan. 2010 La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n'étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ...
La chromatographie sur couche mince (CCM) Principe et mise en
1/ Préparation d'une chromatographie. - On prépare la cuve en y mettant l'éluant et en couvrant pour que la cuve conserve les vapeurs de cet éluant (schéma
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La chromatographie méthode d'analyse physico-chimique sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile
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La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange même très complexe Il existe trois principaux types de chromatographie: • la
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Le chromatogramme correspond à l'aspect de la plaque à l'issue de la chromatographie (voir schémas n°4) On détermine pour chacun des constituants qui ont migré
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(voir schéma) Les gels de silice : C'est la phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie et notamment en C L H P Le gel de silice est constitué
La chromatographie sur couche mince (CCM)
C'est une technique qui permet de séparer les constituants d'un mélange pour divers objectifs :
1/ Préparation d'une chromatographie
- On prépare la cuve en y mettant l'éluant et en couvrant pour que la cuve conserve les vapeurs de cet éluant (schéma n°1) - En dehors de la cuve, les mélanges à étudier sont déposés sur la plaque de CCM (schéma n°2): celle-ci est recouverte d'un gel de silice, la phase stationnaire. On utilise des tubes capillaires très fins pour déposer des petites tâches des échantillons étudiés. (Les substances se fixent ainsi sur le gel de silice) Remarque : les échantillons solides doivent être dissous dans un petit peu de solvant aǀant d'ġtre déposés sur la plaque.ATTENTION: les plaques de CCM sont fragiles.
* Y tracer de légers traits de crayon pour ne pas rayer la siliceʡ * Ne pas y mettre les doigts. - On repère chacun des dépôts - On sèche la plaque pour évaporer le solvant qui accompagne les substances à analyser.2/ Réalisation de la chromatographie
- On place délicatement la plaque dans la cuve et on couvre: la ligne de dépôts doit être au-dessus
de la surface de l'éluant (schéma n°3) L'élution a lieu: l'éluant monte par capillarité le long de
la silice de la plaque. - Quand l'éluant est parvenu à environ 1 cm du sommet de la plaque:· on sort la plaque de la cuve
atteinte par le front de l'éluant (ligne supérieure de la partie humide de la plaque)· on sèche la plaque
Phénomènes observables :
Pendant l'Ġlution ͗ Les substances déposées, entraînées par l'éluant, migrent le long de la phase stationnaire (le gel
de silice). Deux phénomènes sont en compétition: chaque substance est soumise à deux interactions vis àvis
d'une part de la silice et d'autre part de l'éluant (phase mobile). Chaque substance va ainsi pouvoir
être caractérisée par sa migration plus ou moins importante le long de la plaque :- si une substance est particulièrement soluble dans l'éluant, elle sera d'autant plus entraŠnĠe par celui-ci
et montera haut sur la plaque.- si la substance a plus d'affinité pour la phase stationnaire (la silice), elle sera davantage retenue par celle-
ci et migrera peu (elle restera assez bas sur la plaque)Aprğs l'Ġlution ͗ Pour étudier les positions occupées par les substances, on observe les taches qu'elles laissent sur
la plaque: - si ces taches sont colorées, l'étude est immédiate- si ces taches sont incolores (cas fréquent) il faut pratiquer une révélation afin de les rendre visibles.
Différentes méthodes de révélation seront envisagées3/ Exploitation du chromatogramme
Le chromatogramme correspond à l'aspect de la plaque à l'issue de la chromatographie (voir schémas n°4) On détermine, pour chacun des constituants qui ont migré, un rapport frontal : Rf par: Rf =d/D (sans unité) où d désigne la distance parcourue par la substance (en utilisant le haut de la tache) et D désigne la distance parcourue par le front de l'éluant (à partir de la ligne des dépôts) .La valeur du Rf est caractéristique d'une substance. Elle dépend de la composition de l'éluant utilisé.
Lorsque deux taches de deux dépôts différents ont le même Rf (c'est-à-dire qu'elles sont
à la même hauteur sur la plaque), on peut considérer qu'elles correspondent à la même substance.quotesdbs_dbs29.pdfusesText_35[PDF] extraction et purification des protéines
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