1. Définition. 2. Buts de la chromatographie. 2.1. Objectif analytique
La chromatographie sur papier (CP) : le substrat est la charge (eau sels
tp2 : chromatographie sur couche mince des acides amines
But Le but du travail pratique réside dans la séparation des acides aminés par chromatographie de partage sur papier. Matériel et réactifs.
Les techniques Chromatographiques 1.1. Introduction 1.3. Historique
mais aussi et surtout dans un but analytique (petite quantité) qualitatif la chromatographie sur papier (CP) : une surface plane de cellulose considérée.
Titre du projet scientifique
Les paramètres d'une chromatographie sur colonne La chromatographie sur papier ... du but de l'analyse : identification de composants d'un mélange ...
Extraction et séparation de la chlorophylle
mécaniquement et va détruire les membranes des cellules dans le but d'en extraire La chromatographie sur couche mince permet une séparation des pigments ...
Chromatographie sur colonne.pdf
Cette chromatographie est basée sur le même principe que la. CCM sauf que la silice est placée dans une colonne et non sur une plaque. Le but est toutefois
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Cette chromatographie est basée sur le même principe que la. CCM sauf que la silice est placée dans une colonne et non sur une plaque. Le but est toutefois
Analyse dun produit par C.C.M Chromatographie sur Couche Mince
chromatographie de partage liquide/liquide (par exemple sur papier un but analytique : la séparation des constituants d'un mélange est alors la première.
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ainsi en chromatographie sur papier la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent alors qu'en chromatographie en phase
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La chromatographie sur papier Repose sur les phénomènes de partage (solubilité des molécules) Phase mobile : solvant + eau
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Selon la technologie mise en jeu on distingue: - la chromatographie sur colonne - la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie
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la chromatographie sur papier (CP) : une surface plane de cellulose considérée comme support maintient par imbibition une phase stationnaire liquide
La chromatographie Planet-Vie
15 mai 2012 · La chromatographie est une technique qui se décline selon de multiples variantes pour séparer des constituants dans un but soit analytique soit
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La chromatographie sur papier est une chromatographie de partage basée sur la différence de solubilité des espèces à séparer entre deux phases :
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La chromatographie sur papier : une surface de cellulose considérée comme support maintient par imbibition une phase stationnaire liquide
Quelle est le but de chromatographie ?
La chromatographie est une technique permettant de séparer plusieurs constituants d'un mélange en les faisant migrer, sur une phase immobile, par une phase liquide ou gazeuse. Cet article présente les principaux types de chromatographie, avec leur principe de séparation et leurs principales indications.15 mai 2012Quel est le principe de la chromatographie sur papier ?
Le principe de la chromatographie sur papier est simple: la substance qu'on veut analyser est déposée sur la ligne de départ tracée sur le papier. Celui-ci est tenu verticalement L'eau monte par capillarité le long des fibres du papier et entraîner avec elle les substances.Quel est le but de la CCM ?
La chromatographie sur couche mince (abréviation fran?ise: CCM / anglaise: TLC «Thin Layer Chromatography») est une technique chromatographique dite planaire, couramment utilisée pour séparer des composants dans un but analytique ou de purification.- Chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalent utilisée pour séparer les composés présents dans une solution. Un mélange de solution est porté par un solvant à travers une colonne contenant un adsorbant solide, appelé la phase stationnaire.
![Les techniques Chromatographiques 1.1. Introduction 1.3. Historique Les techniques Chromatographiques 1.1. Introduction 1.3. Historique](https://pdfprof.com/Listes/17/30954-17coursTechniquesd_analysesBOUTAGHANE.pdf.pdf.jpg)
Dr BOUTAGHANE.N
Les techniques Chromatographiques
1.1. Introduction
1.2. Définition
La chromatographie, -chimique
mélange (les solutés) par (liquide ou gaz) le (solide ou liquide fixé), grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).1.3. Historique
La chromatographie est une science très ancienne. Ainsi on trouve la première référence d'un
processus chromatographique dans l'Ancien testament qui fait mention de propriétés adsorptives de certaine variété de bois pour adoucir de l'eau amèreLe terme de chromatographie fut employé pour la première fois par le botaniste russe
Michael Tswett en 1903 pour décrire un procédé de séparation des pigments végétaux
colorés (chlorophylle brute) par passage à carbonate de calcium, et éluééther de pétrole. Il a donné à cette technique le nom chromatographie puisque chroma () en grec, signifie couleur et graphein signifie écrire. De nos jours, ce terme recouvre plus généralement toutes les techniques de séparation de substances en solution par passageCette technique fut quasi-
Edgar Lederer a purifié par la méthode de Tswett la lutéine (Pigment présent dans le jaune
Dr BOUTAGHANE.N
En 1931, la publication de Kuhn et Lederer sur la séparation des isomères du carotène et de reçut le Prix Nobel sur la chromatographie en couche minceVers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils
obtiennent le prix Nobel en 1952.1952: Naissance officielle de la chromatographie phase gaz.
1955 .
Fin des années 60 : Naissance de la chromatographie en phase liquide à haute performance
HPLC.La chromatographie
La multiplicité des procédés utilisés confère à la chromatographie une très grande souplesse.
Les chromatographes actuelles sont pilotés par des logiciels informatiques. Elle est employée à des fins préparatives pour séparer des quantités notables de substances, mais aussi et surtout dans un but analytique ( petite quantité) qualitatif ou quantitatif grâce à la très grande sensibilité des moyens de détection et aux substances étalons.2. Classification des méthodes chromatographiques
Il existe plusieurs variantes de techniques chromatographiques, classées de plusieurs manières
différentes :1- selon la nature des phases (mobile et stationnaire).
2- selon Le procédé opératoire.
3- selon le principe des phénomènes mis-en dans la séparation
2.1. Classification selon la nature physique des phases
Selon la nature de la phase mobile on distingue:
la chromatographie en phase liquide (CPL) la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographie en phase supercritique (CPS) Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: la chromatographie liquide/solide (CLS) la chromatographie liquide/liquide (CLL) la chromatographie gaz/solide (CGS) la chromatographie gaz/liquide (CGL).Dr BOUTAGHANE.N
2.2. Selon le support de la chromatographie on distingue:2.2. 1. La chromatographie sur colonne (CC) : la phase stationnaire est contenue dans une
colonne en verre ou en métal2.2. 1. La chromatographie planaire : on distingue deux types
la chromatographie sur papier (CP) : une surface plane de cellulose considérée comme support maintient par imbibition une phase stationnaire liquide.2-la chromatographie sur couche mince (C.C.M) la phase stationnaire est étalée sur
une surface plane (chromatographie planaire) qui peut être en verre en feuille rains de résines échangeuses2.3. Classification selon le principe des phénomènes chromatographiques
La classification des chromatographies peut se faire en fonction des phénomènes ou bien des mécanismes de séparation . Les facteurs qui interviennent dans le partage des moléculesà séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la
l totaleChromatographies en phase liquide CPL
Dans ce cas, la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on
distingue :Les chromatographies de partage
La chromatographie de partage : -liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte sur le partage du soluté dans les deux phases liquides.Dr BOUTAGHANE.N
chromatographie -diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. en phase normale liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. liquide solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire.La phase stationnaire est un échangeur
positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu.La phase stationnaire est un support
macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente
enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).Dr BOUTAGHANE.N
Chromatographies en phase gazeuse (CPG)
La phase mobile est un gaz appelé gaz vecteur ou encore gaz porteur. On distingue dans ce
cas :La chromatographie gaz-liquide
La chromatographie gaz-solide
stationnaire est un solide adsorbant.En résumé
facteurs suivants, afin de séparer des composés constituant un mélange :Facteur Technique chromatographique
Solubilité dans un solvant liquide Chromatographie de partageTaille et forme
Polarité
Charge électrique
La chromatographie de partage
1. Principe
Cette chromatographie liquide-liquide est fondée sur la répartition différentielle de chacun des
comparable à une extraction liquide-liquide.2. Théorie de la partition
- Saq organique (Sorg appelée " coefficient de partage » ou " coefficient de distribution », est égale àK = [ASorg]/ [ASaq].
phases liquides non miscibles, avec [ASorg]: la concentration en soluté A dans la phase
organique et [ASaq]: la concentration en soluté A dans la phase aqueuse. En général, le soluté
Dr BOUTAGHANE.N
est plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux et K est donc supérieurà 1.
s un système chromatographique est rendue possible par la inerte, migrera lentement, la force de rétention prédominant sur un soluté soluble dans la phase mobile migrera rapidement.3. Rapport frontal
On appelle rapport frontal, RF (ou " référence front », " coefficient de migration »), le
rapport Distance parcourue par le soluté / Distance parcourue par le solvant. Le schéma de la figure montre comment calculer le R F ascendante. Un soluté très soluble dans la phase fixe aura un R F la phase mobile aura un RF élevé et proche de 1.
4. Chromatographie bidimensionnelle
Dans le cas où le mélange contient des solutés de mobilités voisines, on peut augmenter le
pouvoir séparateur en réalisant une chromatographie bidimensionnelle : sur le même , puis une dans une direction perpendiculaire à la première (figure).Dr BOUTAGHANE.N
Figure: Chromatographie liquide-liquide bidimensionnelle5. Solvants
Les deux solvants sont caractérisés par leur différence de polarité et leur non miscibilité.
solvant mobile sera nécessités de la séparation. on1. Terminologie et grandeurs de rétention
Chromatogramme
volume graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative.Analyse qualitative
Analyse quantitative
des picsDr BOUTAGHANE.N
Figure:
Elution
phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile peut être appelée éluant.
Le temps mort (tm)
Le temps mot tm est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire de la phase mobile pour traverser la colonne).Le temps de rétention (tr)
C'est le temps que met le soluté à sortir de la colonne c'est à dire le temps écoulé entre
l'injection et le maximum du pic du composé élué ( . Il est noté tr (en minutes).Le temps de
et peuvent .Le temps de rétention réduit ()
soluté dans la phase stationnaire. tm.Dr BOUTAGHANE.N
Le volume de rétention
Vr de chaque soluté représente le volume de phase mobile et celui correspondant au maximum du pic. Si le débit D est constant,Vr = tr.D.
2. Le Principe de la
Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme . On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Les solutés sont donc élués . Il existe une relation linéaire entre le volume illustré schématiquement dans la figure.Figure. : Schéma illustrant le principe de la
Les plus petites molécules peuvent pénétrer dans de nombreux pores, se répartissant entre le gel et la phase mobile, ce qui rend leur trajet plus lent à parcourir et les fait éluer en dernier.Les molécules de taille moyenne peuvent
pénétrer seulement dans quelques pores, la répartition entre le gel et la phase mobile est plus rapide que pour les petites molécules, le trajet parcouru est moins long et elles sont éluées plus rapidement. Finalement, les grosses molécules ne peuvent pénétrer dans les pores du répartition entre la phase mobile et le gel, leur trajet est donc réduit au minimum et elles sontéluées en premier.
Dr BOUTAGHANE.N
3. Types de gels (les phases stationnaires)
- Gels hydratés (les plus utilisés) : le SéphadexTM (G10 à G200) qui sont des polyosides bactériens de type dextran et le Sépharose par gramme de substance sèche. - Gels permanents : Ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici,4. Représentation des résultats
- Soit on porte le logarithme de la masse mo comme indiqué dans la figure ci-dessous : log MM = f(Ve).-Soit on porte le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de
partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f(KAV), avec KAV = (Ve Vm) / (Vt Vm) où Vt est le volume total (mesuré en remplissant la colonne totalement exclue). Figure: Graphique du log de la masse moléculaire en fonction du volume éluéLes grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont
donc toutes éluées les premières, au niveau du volume mort (Vm ou V0). Les petites et
moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est
gênée. Une molécule totalement incluse sera éluée incluse sera éluée avec un volume V* =
Dr BOUTAGHANE.N
se des masses moléculaires. 5. t = V0 + Vi + Vg, où V0 est le volume mort, c'est-à-
d g est le volume du gel. (de partage) : K. - Si K = 0, le soluté est totalement exclus. - Si 0 < K < 1, le soluté est partielleme - Si K = 1, le soluté est totalement inclus dans le gel. - Si K > 1, le soluté est non seulement inclus, mais aussi adsorbé par le gel.Les chromatographies s
1. phase normale
1.1.Principe
Cette chromatographie liquide-
fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par
leur séparation. par lequel des molécules se fixent sur la surface adsorbant, selon divers processus plus ou moins intenses. Le phénomène inverse, parDr BOUTAGHANE.N
1.2.Les adsorbants (les phases stationnaires)
Ce sont des solides très divisés
distinguer : - sodium. détail ultérieurement) ont une faible polarité.1.3. Les solvants
Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, une
température, une pression et un soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant. gel depossède un pouvoir éluant élevé, fortement adsorbé, il déplace le soluté. En revanche, un
pouvoir éluant, mais entraînera un soluté apolaire. Le tableau suivant reprend quelques solvants classés dans1.3. Technologie
Sur colonne : ouverte à pression ambiante, en flash chromatographie, à moyenne pression,
en CLHP (chromatographie liquide haute performance ou haute pression). Sur papier : en chromatographie ascendante ou radiale ; dans cette technique, le papier joue le rôle de phase fixe.Sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coulé sur une plaque (verre,
aluminium, plastique), mélangé à un liant (plâtre).Dr BOUTAGHANE.N
1.3.La chromatographie sur couche mince (CCM)
1.3.1. Définition et appareillage:
Figure: Schéma d'une chromatographie sur couche mince (CCM). La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le longd'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de
matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du
solvant. Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont: la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autreadsobant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de
calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère organique.l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à
analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en
entraînant les composants de l'échantillon.1.3.2. Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant
monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. CetteDr BOUTAGHANE.N
vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque
stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent
donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la
phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption.
Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.1.3.3. Applications de la CCM.
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la
pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents
adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer que cet
échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée
pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie
sur colonne.1.3.4. Adsorbants et plaques chromatographiques.
Par ordre d'importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice,
l'alumine, le kieselguhr et la cellulose. Les plaques vous seront fournies prêtes à l'emploi.1.3.5. Choix de l'éluant.
L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants.Un éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire; celui qui empêche
leur migration ne l'est pas suffisamment.Une méthode simple pour trouver l'éluant approprié consiste à préparer des solutions de
l'échantillon dans différents solvants, en concentration d'environ 2 à 5% en volume. A l'aide
d'une micropipette, on dépose une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée
d'environ 1 cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa migration, a entraîné le
soluté à une distance d'environ la moitié de celle qu'il a parcourue.1.3.6. Dépôt de l'échantillon.
L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas forcément le
même que l'éluant : on emploie fréquemment le méthanol, le trichlorométhane (chloroforme),
Dr BOUTAGHANE.N
la propanone ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un point de la plaque situé à
environ 1 cm de la partie inférieure.Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible;
idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les moins étalés
qui permettent les meilleures séparations. Pour augmenter la quantité déposée, il est toujours
préférable d'effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant rapidement entre chaque
application plutôt que de déposer en une seule fois un grand volume d'échantillon qui
produirait une tache plus large.L'échantillon est déposé à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant
légèrement et brièvement l'extrémité de la pipette sur la couche d'adsorbant en prenant soin de
ne pas le détériorer.1.3.7. Développement de la plaque.
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses usuelles
de laboratoire, le principal type de développement est la chromatographie ascendante : la
plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui en recouvre le fond
monte par capillarité.Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve; on place souvent du
papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer plus rapidement la cuve en vapeurs
d'éluant et éviter les effets de bords. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve
doit demeurer fermée et ne pas être déplacée.Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l'extrémité supérieure, la
plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la
plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un séchoir.Dr BOUTAGHANE.N
1.3.8. Révélation.
L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes (valable également
pour la chromatographie sur papier):1-directement si les substances sont colorées
2-à l'aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches
colorées; les produits sont souvent décelés par leurs réactions fonctionnelles classiques: les acides aminés par la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colorés, les sucres par leréactifde Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres. Quelques réactifs comme
l'iode ou le permanganate donnent des colorations non spécifiques avec la plupart des composés organiques. toutes les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sontétudiées sur des supports additionnnés de corps fluorescents par irradiation de lumière
UV à ondes courtes (l
max< 254 nm). L'emploi de couches non additionnées de produits fluorescents permet aussi la mise en évidence de beaucoup de substances dans l'UV à ondes courtes (l max <254 nm) ou à ondes lon,gues (lmax > 366 nm) par suite de la fluorescence propre des composés.Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées juste à la fin de la
chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.1. Principe
-liquide dans laquelle la phase stationnaire se distingue par son apolarité . Elle est constituée, la plupart du temps, par des silicesapolaires greffées (figure ci- dessous). Il existe des greffons apolaires de tailles différentes, de
2 à 18 atomes de carbone (C2 à C18), donc de polarité différentes.
Dr BOUTAGHANE.N
Figure. : Phase normale et phase inverse : De gauche à droite sont représentées : Une silice non
greffée (phase normale), une silice greffée organosilanée de type C18 (phase inverse) et finalement,
une silice greffée par une chaîne aliphatique de type C18 également (phase inverse).Chromatographie par échange
1.1. Introduction
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