[PDF] Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes





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Chapitre 7 - Hybridation des acides nucléiques : principes et

Pour plus de simplicité nous ne montrons ici qu'un seul brin de sonde marquée. Au cours du passage des molécules de sondes simple brin marquées au contact du 



Marquage et sondes.pdf

Cette réaction sonde- fragment correspond à une réaction d'hybridation moléculaire. Les sondes d'acides nucléiques peuvent être fabriquées sous forme de 



La PCR en temps réel: principes et applications

technologies principales : hydrolyse de sondes (Taqman assay) hybridation de 2 sondes (HybProbes)



C:UsersHamzaDownloadsDocumentsmicrobiologie L3io mol

Pour cela on utilise une molécule appelée sonde qui va se fixer/hybrider spécifiquement au type moléculaire recherché. • On appel hybridation une 



Facteurs influençant lhybridation: Fusion dune molécule dADN

24 févr. 2013 Concept de base : l'hybridation moléculaire sondes. 2°- Les vecteurs de clonage et d'expression - Amplification in vivo.



Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes

Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes. 1. RESUME SUPPLEMENTAIRE. Les types de l'hybridation moléculaire. 1. Hybridation en phase homogène.



Développement doligonucléotides cationiques pour lhybridation

10 janv. 2013 d'amorces ou de sondes pour pouvoir amplifier l'ADN ou détecter une séquence ... destinés à améliorer l'hybridation moléculaire des acides ...





TD1: Hybridation moléculaire

TD1: Hybridation moléculaire (1) dénaturation: “Force” de l'hybridation: Tf ... Objectif du Southern: identifier à l'aide d'une sonde. (connue) d'ADN.



Lhybridation moléculaire : application à la détection spécifique de

Les sondes sont de trois types : ? formées d'ARN : ce sont des Ribosondes ; elles forment un hétéroduplex avec l'ADN cible qui est plus stable qu' 



Chapitre III HYBRIDATION MOLECULAIRE

Chapitre III HYBRIDATION MOLECULAIRE L’hybridation moléculaire est l’association de 2 simples brins d'ADN (ADNs) par formation de liaisons H entre ces deux brins On distingue les hybrides: • ADN-ADN = Homoduplex • ADN-ARN = Hétéroduplex Sondes nucléiques sont des séquences d'acides nucléiques simple brin (d'au moins 15



L’HYBRIDATION MOLECULAIRE

I HYBRIDATION MOLECULAIRE : L’hybridation moléculaire repose sur le principe qu’un fragment ADN simple brin s’apparie à un autre fragment ADN en respectant rigoureusement les règles de complémentarité L’hybridation est réalisée entre une sonde dont la séquence est connue et un segment ADN monobrin obtenu après dénaturation



Chapitre 4 : Le marquage des acides nucléiques 1-

1- Sondes des acides nucléiques : Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire étudier Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d’hybridation moléculaire Les sondes d’acides



L’HYBRIDATION MOLECULAIRE

2-3-3/ Hybridation in situ (HIS): C’est une technique qui permet par l’utilisation de sondes de mettre en évidence et de repérer dans des cellules ou des tissus des séquences d'acides nucléiques connues Elle est très proche dans son principe du Southern et du Northern Blot et repose comme eux sur l'hybridation d'une sonde d'acide



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L’hybridation moléculaire de type Southern – ADN sur ADN (dénaturés) – ADN sonde marqué (radioactivité ou sonde froide) – Incubation à Tm - 20°C – Composition des tampons importante • Sel nécessaire pour neutraliser les phosphates • formamide éventuelle pour abaisser la température d’hybridation

Comment se fait la séparation des produits de l’hybridation ?

La séparation des produits de l’hybridation (ADN simple brin, ADN double brin et hybride ADN/ARN) se fait par centrifugation dans un gradient de concentration de chlorure de Césium. Figure N°5 : Principe de l’hybridation Plusieurs facteurs peuvent influencer le phénomène d’hybridation, à savoir :

Qu'est-ce que la hybridation in situ ?

Hybridation in situ (HIS) C’est une technique qui permet, par l’utilisation de sondes, de mettre en évidence et de repérer, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques connues.

Quels sont les différents types d’hybridation ?

2-3/ Les différents types d’hybridation : 2-3-1/ Hybridation en phase liquide :Les segments complémentaires sont placés dans une solution contenant un tampon et de la formamide. L’agitation thermique assure la liaison entre les fragments complémentaires. Cette température est généralement inférieure de 15°C à la Tm de l’ADN concerné.

Comment calculer la température d’un hybride ?

Cette température est généralement inférieure de 15°C à la Tm de l’ADN concerné. Les hybrides formés sont quantifiés selon trois méthodes : 1. les méthodes spectrophotométriques (la diminution en DO à 260nm est due à l’augmentation du taux des hybrides) 2. la technique de la nucléase S1 (digestion des ADN et ARN simples brins) 3.

Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes 1

RESUME SUPPLEMENTAIRE

1. Hybridation en phase homogène

Dans ces techniques, les séquences à analyser et les réactifs sont tous les deux en milieu liquide détections ont donc lieu dans un volume. Certaines Q-PCR et RT-PCR utilisent des sondes pour rendre le signal ne détecter que les amplifiats spécifiques.

2. Hybridation en phase hétérogène

Dans cette catégorie on trouve toutes les techniques qui passent par la fixation préalable des acides nucléiques à analyser sur un support solide. aire Pour la plupart des techniques une succession de cinq étapes sont nécessaires pour

1) étape de fixation

support solide ;

2) étape de saturation des sites non spécifiques par un ou plusieurs produits (ADN

et ou protéines) ; hybridation des sondes dans des conditions physicochimiques de moyenne stringeance (spécificité moyenne => des hybridations non spécifiques peuvent avoir lieu)

4) plusieurs étapes de lavages en conditions de stringeance croissante pour détruire

les hybrides non spécifiques et démasquer les hybrides spécifiques ;

5) la détection des sondes hybridées, lors de laquelle une ou plusieurs étapes de

lavages permettent s composants adsorbés au support de manière non spécifique.

FISH : fluorescent in situ hybridation

cellules entières préparées sur des supports souvent en verre (slide). Les cellules sont fixées,

perméabilisés et souvent décapées pour exposer les acides nucléiques qui sont

dénaturés pour permettre leur hybridation par les sondes. Lorsque le marquage est fluorescent, on parle de FISH : fluorescent in situ hybridation.

Cette technicaryotypes faciles à analyser, car

chaque paire de chromosome fluoresce dans une couleur spécifique (FISH painting, ou SKY). Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes 2 Le transfert des séquences cibles sur un support adapté permet de faciliter leur dot et slot blot avec les Puces ADN (Southern et Northern blot). dans ce cours,

La première étape consiste à réaliser une électrophorèse pour séparer les acides

nucléiques en fonction de leur taille. En plus de la reconnaissance spécifique des séquences cibles, cette technique fournit en plus une information sur la taille des séquences cibles détectées nom de la technique utilisée. circule par

capillarité, soit par un électrotransfert réalisé dans un système où un champs

Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes 3 électrique est créé perpendiculairement à la surface du gel. Dans les deux cas, une membrane poreuse est disposée sur toute la surface du gel. Cette membrane est

traversée par le courant liquidien dénaturant et reçoit les acides nucléiques à sa

surface en reproduisant

LES SONDES

1. Nature biochimique des sondes

Les sondes sont de trois types :

stables dans le temps à cause de leur sensibilité aux RNases ubiquitaires. Elles sont produites par transcription in vitro. ou bien des oligonucléotides (oligosondes) marqués lors de leur synthèse chimique. - formées de polymères artificiels sur lesquels sont greffés des bases permettant de mimer des séquences nucléiques. Ces molécules non naturelles sont de ce fait peu sensibles aux attaques enzymatiques et donc très stables dans le temps. Par exemple les PNA (peptide nucleic acids) sont des polymères proches des protéines dans lesquelles les chaînes latérales sont constituées de bases nucléiques.

2.Types de marquages

Il existe deux grands types de marquages :

Les marquages chauds, dans lesquels le signal est lié à la radioactivité des sondes qui contiennent un ou plusieurs atomes radioactifs de courte période comme le phosphore 32 (P32) ou le soufre 35 (S35) ou le tritium (H3). Le seul avantage de ce type de marquage est sa sensibilité, mais les méthodes luminométriques permettent de de radio isotopes (coût, dangerosité et élimination de déchets spécifiques). Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes 4 Les marquages froids qui sont de deux types : soit la sonde est liée à un fluorochromeligand qui sera reconnu spécifiquement et avec une forte affinité par une molécule réceptrice. Deux exemples sont bien connus ; le couple biotine / avidine et le couple digoxygénine / anticorps

3 Méthodes de marquage

3.1. Aux extrémités

deux enzymes : la phosphatase alcaline en présence de magnésium permet polynucléotide kinase permet

3.1.2. En

La terminale transférase permet de rajout

dXTP* et de magnésium. Cette enzyme est une ADN polymérase matrice indépendante.

3.2. Dans la séquence

3.2.1. lors de la synthèse des oligosondes

r des bases marquées dans la chaîne, mais il semble plus facile de greffer des marqueurs aux extrémités de ce type de molécules. Lors de transcription in vitro utilisant des ARN polymérases bactériophagiques (T7) des bases marquées peuvent être ajoutées. ouble brin, on peut obtenir des mélanges de séquences marquées spécifiques de cette séquence cible en Résumé supplémentaire : Hybridation moléculaire & Sondes 5 faisant incorporer des bases marquées par la polymérase. Les techniques utilisées sont : le multi-amorçage aléatoire (random priming) dans lequel une collection de toutes les amorces possibles (hexanucléotides) est hybridée sur les séquences cibles dénaturées pour le déplacement de coupure (nick translation) dans lequel un mélange optimisé de DNase I et ADN polymérase permet de générer des coupures simples brins sur les deux brins qui servent collection de sondes obtenues; la PCR.quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44
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