[PDF] Quattendre de la Biologie Moléculaire en Bactériologie





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PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D’APPLICATION AU DIAGNOSTIC I TECHNIQUES DE BASE A Extraction des acides nucléiques 1/ Extraction de l’ADN Technique classique Les Kits Il existe maintenant des kits qui permettent un gain de temps (Biosciences Amersham ) À partir de 5 ml de sang: - Hémolyse des



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Une fois le duplexe temporaire est formé la sous-unité ? se dissocie de l'holoenzyme et l'élongation de la chaine se poursuit sous la direction de la partie centrale de l'enzyme (fig 3) Chez E coli ce processus progresse à la vitesse d'environ 50 nucléotides/seconde à 37°C



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Comment fonctionne la biologie moléculaire?

• les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellement basées su lhybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques (C, T et U) • Grace à ces lois de complémentarité, il est possile dassoie un in daide nuléiue ave une sonde et de reconnaitre le gène ou la séquence étudiée.

Quels sont les différents types de techniques de biologie moléculaire ?

Il n'existe aucune autre technique directe commercialisée et les techniques de biologie moléculaire restent du domaine de la recherche. Les sérologies sont donc les méthodes les plus utilisées mais d'interprétation difficile en raison de la prévalence élevée de C. pneumoniae et des réactions croisées entre espèces de Chlamydia.

Quels sont les outils de biologie moléculaire?

Les outils de biologie moléculaire sont devenus des moyens performants de plus en plus utilisés dans le diagnostic spécifique et même intra-spécifique des organismes. Ils reposent sur la connaissance du génome des organismes recherchés.

Quels sont les travaux pratiques de biologie moléculaire ?

Les travaux pratiques de Biologie moléculaire du semestre S5 ( TP S5) couvrent l'extraction de l'ADN (DNA) de plantes, son hydrolyse par des enzymes de restriction comme Hind III et sa séparation sur gel d'agarose. Ce TP permet de se familiariser avec les techniques de séparation en Biochimie et l' électrophorèse, en particulier.

Qu'attendre de la Biologie Moléculaire

en Bactériologie

Florence DOUCET-POPULAIRE

Centre Hospitalier de Versailles

Université Paris 5

Particularités liées à la Bactériologie

Bactérie non cultivable ou culture longue

ou fastidieuseMajorité des bactéries d'intérêt médical sont cultivables (Techniques plus ou moins longues mais peu coûteuses) Recherche cibléeFlore commensale importante et variée

Quantification

Rapport coût / efficacité

" Pathogènicité »

Réponse

Sensible (une copie)

Spécifique (cible)

Fiable (VPP et VPN élevées)

Exacte (absence de faux négatifs et faux

positifs)

Rapide (

Applications en Bactériologie

des techniques de biologie moléculaire

Détection agent pathogène

Amplification génétique

Identification

Sondes

Séquençage

Détection des mécanismes de résistance

Épidémiologie

Typage moléculaire

Diagnostic des infections à Mycobactéries

Amplification génique pour le diagnostic

bactériologique de la tuberculose 1

ère

publication en 1989 (Brisson-Noël et al.,

Lancet)

Fin des années 90, Commercialisation de

kits d'amplification génique

En parallèle, développement :

des techniques d'identification par sonde Détection de la résistance aux antituberculeux

Epidémiologie moléculaire

Début du 3

ème

millénaire ...

Diagnostic bactériologique de la Tuberculose

en 2005

Examen microscopique

3 hAmplification génique

24 h

3 à 6 S

1 à 4 SCulture

MilieuMilieu

Solideliquide

Détection de la

résistance

à la rifampicine et à

l'INH 6 hIdentification par sonde génomique

2 à 12 h

Prélèvement

Fluidification-Décontamination

Culot de centrifugation

ATBg milieu

solide 3 à 5 S

Identification

biochimique 3 S

Epidémiologie moléculaire

24 h

ATBg milieu liquide

1 à 2 S

Amplification Génique

Scarparo et al., 2000

Cobas amplicor

Tous prélèvements

AMTD

Tous prélèvements

94
9975
86
9266
100

100100

100

100100

Sensibilité (%)

Spécificité %)

Méthode

296 prélèvements pulmonaires

Examen microscopiqueCulture

7791
94
100

Résultats de Méta-analyses récentes sur

l'exactitude des tests d 'amplification génique pour la tuberculose

PublicationNb d'études

inclusesType de tuberculoseSensibilité Spécificité

Sarmiento et al.

200350Pulmonaire

(µ-)9 - 100% 25 - 100%

Piersimoni et

Scarpuro, 2003>50Pulmonaire et

extrapulmonaire27 - 100% 91 - 100%

Pai et al. 2004 40 Pleurésie20 - 100%

(62%)53 - 100% (98%)

Pai et al. 2003 49 Méningite 0 - 100% 0 - 100%

Pai et al.

Lancet Inf. Dis. 2003

56 %98 %

Qu'attendre de l'Amplification Génique

Manque sensibilité, notamment sur les

prélèvements µ -

Faux négatifs

-Présence d'inhibiteur de l'amplification génique (1 à 5% des prélèvements respiratoires) -Faible volume analysé / culture

Existence de faux positifs

-Réaction croisée -Contaminations (séparation zones pré et post amplification)

Réponse rapide (24 h)

Bonne spécificité (95-100%)

Amplification Génique et Tuberculose

Recommandations actuelles

Ne remplace pas le diagnostic bactériologique

traditionnel

Chez certains patients nécessitant une mise au

traitement rapide Utilisation préférentielle sur les prélèvements µ +

Analyse critique du résultat

un résultat - n'exclut pas une tuberculose un résultat + doit être confirmé (signes cliniques)

Toujours associer une culture

Ne pas utiliser pour le suivi du traitement

Conclusion :Nécessité de méthodes

plus sensibles et spécifiques

Bordetella

pertussis un pathogène oublié <1 heure

Extraction de l 'ADN

PCR classique

Migration sur

gel d'électrophorèse

Détection du

produit amplifié Sonde d'hybridation

PCR en temps

réel

Incubation

37°C sans

C02

Identification des colonies

visibles en 3 à 6jours

Examen

J3, J5, J7, J10

3h

24h-48h

Culture

Analyses des résultats de PCR et de

culture des 215 aspirations nasopharyngées 6 (2,8%)42 (19,5%)167

(77,7%)215Total1143146 (21,4%)Non réalisée316019(8,8%)Positive212136150 (69,8%)NégativeInhibiteursPositiveNégativePCR

N (%)Culture

Doucet-Populaire et al, Arch. Ped. 2002. 1145-1152

Difficultés techniques ou d'interprétation

des techniques de Biologie moléculaire

Résultat ininterprétable.

Prélèvement plurimicrobien (infection

plurimicrobienne ou présence d'une flore commensale)

Faux négatif

Inoculum inférieur au seuil de détection

Faux négatif

Choix du fragment de biopsie à analyser -

hétérogénéité de l'échantillon

Faux négatif

Bactérie ou prélèvement biologique difficile à lyser

Faux positif

Hybridation non spécifique des amorces

Faux négatif

Inhibition de l'amplification par des substances

présentes dans le prélèvement biologique (charbon présent dans les flacons d'hémocultures, ...)

Faux positif

Contamination de laboratoire

pertinence clinique ? Mise en évidence de bactéries non viablesConséquencesDifficultés

Conclusion

Meilleure prise en charge du patient

Identification Détection

Mécanisme

de résistanceÉpidémiologie

Rapidité

SpécificitéSensibilité

Signification

Exactitude

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