Nouvelles techniques de biologie moléculaire
Sep 12 2019 La biologie moléculaire désigne l'étude des acides nucléique
Techniques utilisées en Biologie moléculaire
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Apport de la biologie moléculaire au diagnostic des parasitoses
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APPLICATION DES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE A L'ETUDE. DE LA DIVERSITE GENETIQUE DES CHAMPIGNONS PHYTOPATHOGENES. Diana FERNANDEZ.
Techniques de biologie moléculaire comme outils de gestion des
Tout comme pour l'ADNmt l'analyse de l'ADN nucléaire simple copie par amplification PCR et séquençage est envisageable quoiqu'aucun exemple d'application pour
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Quattendre de la Biologie Moléculaire en Bactériologie
Applications en Bactériologie des techniques de biologie moléculaire. Détection agent pathogène. Amplification génétique. Identification. Sondes. Séquençage.
PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D
PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D’APPLICATION AU DIAGNOSTIC I TECHNIQUES DE BASE A Extraction des acides nucléiques 1/ Extraction de l’ADN Technique classique Les Kits Il existe maintenant des kits qui permettent un gain de temps (Biosciences Amersham ) À partir de 5 ml de sang: - Hémolyse des
Cours de Biologie Moléculaire - Université de Bouira
Une fois le duplexe temporaire est formé la sous-unité ? se dissocie de l'holoenzyme et l'élongation de la chaine se poursuit sous la direction de la partie centrale de l'enzyme (fig 3) Chez E coli ce processus progresse à la vitesse d'environ 50 nucléotides/seconde à 37°C
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-Bases fondamentales de biologie moléculaire - Polymorphisme de l’ADN -Bases de pathologie moléculaire - Outils utilisés en biologie moléculaire : - Amplification génique : PCR et autres techniques - Principales techniques de détection des mutations - Micro-arrays (puces à ADN) - Séquençage de l’ADN nouvelles te hniques à haut
Comment fonctionne la biologie moléculaire?
• les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellement basées su lhybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques (C, T et U) • Grace à ces lois de complémentarité, il est possile dassoie un in daide nuléiue ave une sonde et de reconnaitre le gène ou la séquence étudiée.
Quels sont les différents types de techniques de biologie moléculaire ?
Il n'existe aucune autre technique directe commercialisée et les techniques de biologie moléculaire restent du domaine de la recherche. Les sérologies sont donc les méthodes les plus utilisées mais d'interprétation difficile en raison de la prévalence élevée de C. pneumoniae et des réactions croisées entre espèces de Chlamydia.
Quels sont les outils de biologie moléculaire?
Les outils de biologie moléculaire sont devenus des moyens performants de plus en plus utilisés dans le diagnostic spécifique et même intra-spécifique des organismes. Ils reposent sur la connaissance du génome des organismes recherchés.
Quels sont les travaux pratiques de biologie moléculaire ?
Les travaux pratiques de Biologie moléculaire du semestre S5 ( TP S5) couvrent l'extraction de l'ADN (DNA) de plantes, son hydrolyse par des enzymes de restriction comme Hind III et sa séparation sur gel d'agarose. Ce TP permet de se familiariser avec les techniques de séparation en Biochimie et l' électrophorèse, en particulier.
Qu'attendre de la Biologie Moléculaire
en BactériologieFlorence DOUCET-POPULAIRE
Centre Hospitalier de Versailles
Université Paris 5
Particularités liées à la BactériologieBactérie non cultivable ou culture longue
ou fastidieuseMajorité des bactéries d'intérêt médical sont cultivables (Techniques plus ou moins longues mais peu coûteuses) Recherche cibléeFlore commensale importante et variéeQuantification
Rapport coût / efficacité
" Pathogènicité »Réponse
Sensible (une copie)
Spécifique (cible)
Fiable (VPP et VPN élevées)
Exacte (absence de faux négatifs et faux
positifs)Rapide ( Applications en Bactériologie
des techniques de biologie moléculaire Détection agent pathogène
Amplification génétique
Identification
Sondes
Séquençage
Détection des mécanismes de résistance
Épidémiologie
Typage moléculaire
Diagnostic des infections à Mycobactéries
Amplification génique pour le diagnostic
bactériologique de la tuberculose 1 ère
publication en 1989 (Brisson-Noël et al., Lancet)
Fin des années 90, Commercialisation de
kits d'amplification génique En parallèle, développement :
des techniques d'identification par sonde Détection de la résistance aux antituberculeux Epidémiologie moléculaire
Début du 3
ème
millénaire ... Diagnostic bactériologique de la Tuberculose
en 2005 Examen microscopique
3 hAmplification génique
24 h
3 à 6 S
1 à 4 SCulture
MilieuMilieu
Solideliquide
Détection de la
résistance à la rifampicine et à
l'INH 6 hIdentification par sonde génomique 2 à 12 h
Prélèvement
Fluidification-Décontamination
Culot de centrifugation
ATBg milieu
solide 3 à 5 S Identification
biochimique 3 S Epidémiologie moléculaire
24 h
ATBg milieu liquide
1 à 2 S
Amplification Génique
Scarparo et al., 2000
Cobas amplicor Tous prélèvements
AMTD Tous prélèvements
94
9975
86
9266
100
100100
100
100100
Sensibilité (%)
Spécificité %)
Méthode
296 prélèvements pulmonaires
Examen microscopiqueCulture
7791
94
100
Résultats de Méta-analyses récentes sur
l'exactitude des tests d 'amplification génique pour la tuberculose PublicationNb d'études
inclusesType de tuberculoseSensibilité Spécificité Sarmiento et al.
200350Pulmonaire
(µ-)9 - 100% 25 - 100% Piersimoni et
Scarpuro, 2003>50Pulmonaire et
extrapulmonaire27 - 100% 91 - 100% Pai et al. 2004 40 Pleurésie20 - 100%
(62%)53 - 100% (98%) Pai et al. 2003 49 Méningite 0 - 100% 0 - 100%
Pai et al. Lancet Inf. Dis. 2003
56 %98 %
Qu'attendre de l'Amplification Génique
Manque sensibilité, notamment sur les
prélèvements µ - Faux négatifs
-Présence d'inhibiteur de l'amplification génique (1 à 5% des prélèvements respiratoires) -Faible volume analysé / culture Existence de faux positifs
-Réaction croisée -Contaminations (séparation zones pré et post amplification) Réponse rapide (24 h)
Bonne spécificité (95-100%)
Amplification Génique et Tuberculose
Recommandations actuelles
Ne remplace pas le diagnostic bactériologique
traditionnel Chez certains patients nécessitant une mise au
traitement rapide Utilisation préférentielle sur les prélèvements µ + Analyse critique du résultat
un résultat - n'exclut pas une tuberculose un résultat + doit être confirmé (signes cliniques) Toujours associer une culture
Ne pas utiliser pour le suivi du traitement
Conclusion :Nécessité de méthodes
plus sensibles et spécifiques Bordetella
pertussis un pathogène oublié <1 heure Extraction de l 'ADN
PCR classique
Migration sur
gel d'électrophorèse Détection du
produit amplifié Sonde d'hybridation PCR en temps
réel Incubation
37°C sans
C02 Identification des colonies
visibles en 3 à 6jours Examen
J3, J5, J7, J10
3h 24h-48h
Culture
Analyses des résultats de PCR et de
culture des 215 aspirations nasopharyngées 6 (2,8%)42 (19,5%)167 (77,7%)215Total1143146 (21,4%)Non réalisée316019(8,8%)Positive212136150 (69,8%)NégativeInhibiteursPositiveNégativePCR
N (%)Culture
Doucet-Populaire et al, Arch. Ped. 2002. 1145-1152 Difficultés techniques ou d'interprétation
des techniques de Biologie moléculaire Résultat ininterprétable.
Prélèvement plurimicrobien (infection
plurimicrobienne ou présence d'une flore commensale) Faux négatif
Inoculum inférieur au seuil de détection
Faux négatif
Choix du fragment de biopsie à analyser -
hétérogénéité de l'échantillon Faux négatif
Bactérie ou prélèvement biologique difficile à lyser Faux positif
Hybridation non spécifique des amorces
Faux négatif
Inhibition de l'amplification par des substances
présentes dans le prélèvement biologique (charbon présent dans les flacons d'hémocultures, ...) Faux positif
Contamination de laboratoire
pertinence clinique ? Mise en évidence de bactéries non viablesConséquencesDifficultés Conclusion
Meilleure prise en charge du patient
Identification Détection
Mécanisme
de résistanceÉpidémiologie Rapidité
SpécificitéSensibilité
Signification
Exactitude
quotesdbs_dbs19.pdfusesText_25
Applications en Bactériologie
des techniques de biologie moléculaireDétection agent pathogène
Amplification génétique
Identification
Sondes
Séquençage
Détection des mécanismes de résistance
Épidémiologie
Typage moléculaire
Diagnostic des infections à Mycobactéries
Amplification génique pour le diagnostic
bactériologique de la tuberculose 1ère
publication en 1989 (Brisson-Noël et al.,Lancet)
Fin des années 90, Commercialisation de
kits d'amplification géniqueEn parallèle, développement :
des techniques d'identification par sonde Détection de la résistance aux antituberculeuxEpidémiologie moléculaire
Début du 3
ème
millénaire ...Diagnostic bactériologique de la Tuberculose
en 2005Examen microscopique
3 hAmplification génique
24 h3 à 6 S
1 à 4 SCulture
MilieuMilieu
Solideliquide
Détection de la
résistanceà la rifampicine et à
l'INH 6 hIdentification par sonde génomique2 à 12 h
Prélèvement
Fluidification-Décontamination
Culot de centrifugation
ATBg milieu
solide 3 à 5 SIdentification
biochimique 3 SEpidémiologie moléculaire
24 hATBg milieu liquide
1 à 2 S
Amplification Génique
Scarparo et al., 2000
Cobas amplicorTous prélèvements
AMTDTous prélèvements
949975
86
9266
100
100100
100100100
Sensibilité (%)
Spécificité %)
Méthode
296 prélèvements pulmonaires
Examen microscopiqueCulture
779194
100
Résultats de Méta-analyses récentes sur
l'exactitude des tests d 'amplification génique pour la tuberculosePublicationNb d'études
inclusesType de tuberculoseSensibilité SpécificitéSarmiento et al.
200350Pulmonaire
(µ-)9 - 100% 25 - 100%Piersimoni et
Scarpuro, 2003>50Pulmonaire et
extrapulmonaire27 - 100% 91 - 100%Pai et al. 2004 40 Pleurésie20 - 100%
(62%)53 - 100% (98%)Pai et al. 2003 49 Méningite 0 - 100% 0 - 100%
Pai et al.Lancet Inf. Dis. 2003
56 %98 %
Qu'attendre de l'Amplification Génique
Manque sensibilité, notamment sur les
prélèvements µ -Faux négatifs
-Présence d'inhibiteur de l'amplification génique (1 à 5% des prélèvements respiratoires) -Faible volume analysé / cultureExistence de faux positifs
-Réaction croisée -Contaminations (séparation zones pré et post amplification)Réponse rapide (24 h)
Bonne spécificité (95-100%)
Amplification Génique et Tuberculose
Recommandations actuelles
Ne remplace pas le diagnostic bactériologique
traditionnelChez certains patients nécessitant une mise au
traitement rapide Utilisation préférentielle sur les prélèvements µ +Analyse critique du résultat
un résultat - n'exclut pas une tuberculose un résultat + doit être confirmé (signes cliniques)Toujours associer une culture
Ne pas utiliser pour le suivi du traitement
Conclusion :Nécessité de méthodes
plus sensibles et spécifiquesBordetella
pertussis un pathogène oublié <1 heureExtraction de l 'ADN
PCR classique
Migration sur
gel d'électrophorèseDétection du
produit amplifié Sonde d'hybridationPCR en temps
réelIncubation
37°C sans
C02Identification des colonies
visibles en 3 à 6joursExamen
J3, J5, J7, J10
3h24h-48h
Culture
Analyses des résultats de PCR et de
culture des 215 aspirations nasopharyngées 6 (2,8%)42 (19,5%)167(77,7%)215Total1143146 (21,4%)Non réalisée316019(8,8%)Positive212136150 (69,8%)NégativeInhibiteursPositiveNégativePCR
N (%)Culture
Doucet-Populaire et al, Arch. Ped. 2002. 1145-1152Difficultés techniques ou d'interprétation
des techniques de Biologie moléculaireRésultat ininterprétable.
Prélèvement plurimicrobien (infection
plurimicrobienne ou présence d'une flore commensale)Faux négatif
Inoculum inférieur au seuil de détection
Faux négatif
Choix du fragment de biopsie à analyser -
hétérogénéité de l'échantillonFaux négatif
Bactérie ou prélèvement biologique difficile à lyserFaux positif
Hybridation non spécifique des amorces
Faux négatif
Inhibition de l'amplification par des substances
présentes dans le prélèvement biologique (charbon présent dans les flacons d'hémocultures, ...)Faux positif
Contamination de laboratoire
pertinence clinique ? Mise en évidence de bactéries non viablesConséquencesDifficultésConclusion
Meilleure prise en charge du patient
Identification Détection
Mécanisme
de résistanceÉpidémiologieRapidité
SpécificitéSensibilité
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