[PDF] Apport de la biologie moléculaire au diagnostic des parasitoses





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Nouvelles techniques de biologie moléculaire

Sep 12 2019 La biologie moléculaire désigne l'étude des acides nucléique



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Comment fonctionne la biologie moléculaire?

• les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellement basées su lhybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques (C, T et U) • Grace à ces lois de complémentarité, il est possile dassoie un in daide nuléiue ave une sonde et de reconnaitre le gène ou la séquence étudiée.

Quels sont les différents types de techniques de biologie moléculaire ?

Il n'existe aucune autre technique directe commercialisée et les techniques de biologie moléculaire restent du domaine de la recherche. Les sérologies sont donc les méthodes les plus utilisées mais d'interprétation difficile en raison de la prévalence élevée de C. pneumoniae et des réactions croisées entre espèces de Chlamydia.

Quels sont les outils de biologie moléculaire?

Les outils de biologie moléculaire sont devenus des moyens performants de plus en plus utilisés dans le diagnostic spécifique et même intra-spécifique des organismes. Ils reposent sur la connaissance du génome des organismes recherchés.

Quels sont les travaux pratiques de biologie moléculaire ?

Les travaux pratiques de Biologie moléculaire du semestre S5 ( TP S5) couvrent l'extraction de l'ADN (DNA) de plantes, son hydrolyse par des enzymes de restriction comme Hind III et sa séparation sur gel d'agarose. Ce TP permet de se familiariser avec les techniques de séparation en Biochimie et l' électrophorèse, en particulier.

M-H Bessières Parasitologie-Mycologie

CHU - Toulouse

Apport de la biologie moléculaire

au diagnostic des parasitoses MM--H BESSIERESH BESSIERES, S. CASSAING , A. BERRY, R. FABRE, , S. CASSAING , A. BERRY, R. FABRE, J

J--FF. MAGNAVAL. MAGNAVAL

Service de Service de ParasitologieParasitologie--MycologieMycologieCHU CHU --ToulouseToulouse

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CHU - Toulouse

Majorité des cas

diagnostic direct morphologique ou/et sérologique Diagnostic biologique dDiagnostic biologique d''une parasitoseune parasitose

OBJECTIF

TRAITEMENT

SIMPLE

RAPIDE

SENSIBLE

SPECIFIQUE

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DIAGNOSTIC DIRECT

Diagnostic de certitude

Mise en évidence du parasite

+- facile

Prélèvements : selles, urine, LCR, sang...

Diagnostic morphologique

-Observation microscopique -examen direct du prélèvement et méthodes de concentration

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Diagnostic morphologique

Inconvénients

Personnel entraîné, équipement minimum

Observation microscopique longue et

parfois difficile

Peu sensible

Ne permet pas dans tous les cas un

diagnostic d'espèce

Méthodes peu adaptées pour les parasites

tissulaires culture et inoculation aux animaux : toxoplasme - leishmanie

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CHU - Toulouse

DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE

DETECTION D'ANTICORPS OU D'ANTIGENES

FRÉQUEMMENT PRATIQUÉ

-Nombreuses techniques commercialisées sensibles, simples à réaliser, automatisables

INCONVENIENTS

-Pas toujours possible de différencier une infection évolutive d' une immunité -Réaction croisée Helminthes -Distinction difficile entre les parasites d'un même genre -Peu performant chez les immunodéprimés

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CHU - Toulouse

Arc 5 HYDATIDOSE

IMMUNOBLOTTING

P16P16P14P14

DIAGNOSTIC SEROLOGIQUEDIAGNOSTIC SEROLOGIQUE

sp spéécifiquecifique

Leishmaniose

Toxoplasmose

oculaireIMMUNOELECTROPHORESE HAS

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CHU - Toulouse

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

EN PARASITOLOGIE

A PRATIQUER

Lorsque le diagnostic morphologique ou

sérologique est impossible ou peu adapté

DETECTION DE L'AGENT INFECTIEUX =

RECHERCHE D' ADN par PCR

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PCR EN PARASITOLOGIE

POINTS ESSENTIELS

TECHNIQUE MANUELLE

-trousse non commercialisée -mise au point au laboratoire à chaque étape -dépendante opérateur : grande rigueur

VALIDER LE TEST

sensibilité, spécificité, répétabilité, reproductibilité contrôles de la réaction PCR négatif et positif

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CHU - Toulouse

Mise au point au laboratoire

Extraction de l 'ADN de l'échantillon

-en faible quantité / ADN humain -divers procédés, évolue vers l'automatisation CHOIX g

ène cible, séquences des amorces,

sondes fonction de l'agent infectieux optimiser la réaction PCR -volume d'échantillon -Nombre de cycles en présence d 'UracylADNglycosylase -Détection des produits amplifiés BET, sondes

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CHU - Toulouse

Nouvelle approche

PCR en temps réel

Processus automatisé

-détection et quantification d'un émetteur fluorescent -émission directement proportionnel à la quantité d'amplicons générés pendant la PCR

Rapide : < 2 H

Pas de manipulation post-PCR

Réduction du risque de contamination

Permet de quantifier l'ADN amplifié

Bonne reproductibilité

Evolution vars la standardisation

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APPLICATIONS BIOLOGIE MOLECULAIRE EN

PARASITOLOGIE

TOXOPLASMOSE

PALUDISME

LEISHMANIOSE

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Diagnostic moléculaire

Toxoplasmose

Indispensable pour

-Diagnostic de l'infection congénitale •Diagnostic prénatal •Diagnostic néonatal -Diagnostic de l'infection chez les patients immunodéprimés -Non pratiqué pour le diagnostic de la toxoplasmose chez les immunocompétents : caractère éphémère de la parasitémie

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Diagnostic

moléculaire de la toxoplasmose congénitale

Prélèvements

LIQUIDE AMNIOTIQUE (LA) : diagnostic prénatal

PLACENTA et CORDON : dépistage néonatal

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Sensibilité et spécificité

de la PCR dans le liquide amniotique

56814827094Nombre

patientes

491/499

98%50/69

72%

EMSCOT

Étude multicentrique

européenne 2005 BESSIERES et al 2002

ROMAND et al 2001ROBERT-GANGNEUX et

al.1999

AuteursAuteurs

88/88

100%54/60

90%195/195

100%48/75

64%73/73

100%16/21

76%SpécificitéSensibilitéNon infectésInfectés

ThalibThalibet al BJOG 2005 112 567et al BJOG 2005 112 567--574574

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Diagnostic prénatal

PCR Liquide amniotique

Sensibilité variable mais bonne spécificité -réponse rapide moins de 48 à 72 h -remplace inoculation souris

Quantification ADN LA par PCR temps réel*

-<10 toxo/ml 46 % des cas -entre 10 et 100 toxo/ml 30 % -> 100 toxo/ml 24 % -charge parasitaire élevée et infection maternelle précoce risque élevé d'infection sévère *Costa et al Prenat Costa et al Prenat diagndiagn2001 21 852001 21 85--8888

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PCR LA EXAMEN INDISPENSABLE

Diagnostic de la toxoplasmose congénitale

Tous les cas ne sont pas diagnostiqués

Faux négatifs

-méthodes +- sensibles / laboratoire -quantité d 'ADN cible insuffisante pour initier la réaction : faible charge parasitaire

-inhibition non spécifique de la réaction PCR-foetus non contaminés à la date de l'amniocentèse

•passage retardé du parasite au FOETUS

Bilan néonatal et postnatal obligatoire pour

confirmer ou exclure l'infection congénitale

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Autres applications

Diagnostic de l'infection toxoplasmique chez

les patients immunodéprimés VIH

Transplantés

Greffés de moelle

Détection du toxoplasme par PCR

Examen essentiel et urgent

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SANG

HUMEUR AQUEUSE

LCR LBA

MOELLE OSSEUSE

BIOPSIE

musculaire cérébrale...PRELEVEMENTS multiples fonction du contexte clinico-biologique avant th avant théérapeutiquerapeutique

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Diagnostic moléculaire

Toxoplasmose et immunodépression

100%100%LBA45% 59% LCR75%100%42%SANGpulmonairedisséminéecérébrale

SENSIBILITE

PrélèvementFORMES CLINIQUES TOXOPLASMOSE

Compilation de rCompilation de réésultats*sultats*--Patients non traitPatients non traitéés s

PCR : spécificité élevée

*d*d''apraprèès s Bastien P. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002,96,S1205-215

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INFLUENCE THERAPEUTIQUE

RESULTATS PCR*

Incidence toxoplasmose

253 IMMUNODEPRIMES

VIH : 12.3% (22 /179)

autres ID : 2.7% (2/74) PCR+

Patients VIH+ non traités 87 % sang

60% LCR

Traités ou prophylaxie Pneumocystis

25 % SANG

17% LCR

**FoudrinierFoudrinieret al et al ScandScandJ Infect Dis 1996 383J Infect Dis 1996 383--386386

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PCR et suivi allogreffés de moelle osseuse

Étude européenne multicentrique *

EVALUER INTÉRÊT PCR SANG

Méthode

PCR sang 1 fois/semaine (100

ème

j) puis tous les 15 jours 180

ème

j post-greffe patients immunisés

Définitions :

Toxoplasmose infection (TI) : PCR+ sang +/- fièvre.

Toxoplasmose maladie (TM) : diagnostic clinique

(encéphalite ++, formes polyviscérales) radiologique et PCR+ sang, LCR ou LBA.

**MartinoMartinoR et al.R et al.Clinical infectious diseasesClinical infectious diseases. 2005; 40: 67. 2005; 40: 67--78.78.

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Analyse des données patients immunisés*

TI précède TM (J35 vs J64)

•Incidence TI env. 16% et TM 6 %quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44
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