[PDF] [PDF] ADN ARN - Biologie Moléculaire - Faculté des Sciences de Rabat

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Faculté

sSci nc sRabat

Laboratoir

Microbiologi tBiologi Moléculair

Filièr SVI-S4Mo

ul Biochimi tBiologi Moléculair Elém nt2:Biologi Moléculair

1.1.Extraction

sADN1.2.Extraction sARN1.3.Extraction splasmi s

1.3.1.Plasmi

s/curag splasmi s1.3.2.PuriKicationparLys alcalin 1.3.3.PuriKicationparGra i nt chlorur césium

1.PuriKication

saci snucléiqu s2.Séparation saci snucléiqu s3.Notion

Cart s

r strictions splasmi s -El ctrophorès surg l 'agaros =t chniqu p rm ttant 'isol rl'ADNSoitàpartirdecellulessoitdetissus.

Pourquoi?

saci snucléiqu s1.1.Extraction l'ADN saci snucléiqu s1.1.Extraction

l'ADNApa rtirdec llul s(bactéries,levures,cellules sanguines...)oudetissus(végétal,animal)OuencoreApartirdelamatièr fraîch (feuillesdeplantes...)oudelamatièr sèch (phanères...)

Différentesvariantesemployées:l'ADNgénomiqu (issuduoudeschromosomesdescellulesanalysées)Oul'ADNplasmi

iqu (provenantdeplasmidesportésleplussouventp ardescellulesbactéri ennescommeEscherichiacoli).1.PuriKication

saci snucléiqu s1.1.Extraction l'ADN Kitscommerciaux àextractionsrapidesàl'aidederéa ctifsprêtsàl'emploi. saci snucléiqu s1.1.Extraction l'ADN① Lys sc llul s② Elimination sprotéin s③ Elimination sautr saci snucléiqu s(ARN...)④ Conc ntration l'ADNparprécipitationàl'alcool lysedescellulesoudestissus

=broyageoupas+extraction/détergents• disperserlesbicoucheslipidiquesdesmembranes• dénaturerlesprotéinessrttcellesassociéesàl'ADNdanslachromatine

Solutiontrèsvisqueuse

Préparation

'ADNgénomiqu 1/4 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 8

tamponsanspressionosmotique,faisantéclaterlesmembranesferméesEDTAinhibelesnucléasesenchélatantlesionsMg++&Ca++SDS dénature les lipoprotéines membranaires et les enzymes lysosomiales et libère ainsi l'ADN tout en préservant sa structure.

Préparation

'ADNgénomiqu 2/4 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 10

Phénol=agentdéprotéinisant

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 11 L'ADN collecté/centrifugation à dissous dans Tampon o u Eau pure. précipitationdel'ADN =addition d'éthanol ou d'isopropanol dans la phase aqueuse

Préparation

'ADNgénomiqu 3/4 Pour éliminer les ARNsà Traitement par l'ARNase. 4/4 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 12

Pour éliminer les traces de phénol et d 'autres cont aminants (prot., enz...) à dialyse ou purification par chromatographie en colonne de gel dénaturant ou d'adsorption.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 13

SPECTROPHOTOMETRIEàUV

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 14

ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL D'AGAROSE

ADN natif non digéré

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 15 =t chniqu p rm ttant 'isol rl'ARNdecellulesoudetissus.

Pourquoi?

L'ARNextraitàhybridation(Northernblot),banquesADNc,RT-PCR...Différentsprotocolespourextrairel'ARNavecmêmeschémadeprincipequepourl'ADN MAISavecbeaucoupplus deprécautions...

1.2.Extraction

l'ARN TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 16

" Lysecellulairemécanique(congélation,billesdecéramiqueoudétergents)ouenzymatique(lysozymeoulalyticase)" ProtectiondesARNdel'actiondesARNases.Unefoislescellulesconvenablementlysées,lesARN,protégésdel'actiondesRNAses,peuventêtreextraits.L'extractiondesARNpeutêtreréalisée selondeux grandsprincipes:1) lesdifférenc esdepropriétésphysico-chimiq uesentr elesdifférentsacidesnucléiquesetlesprotéines;2) l'adsorptionsélectivedesacidesnucléiquessu runsupportsolide.

1.2.Extraction

l'ARN

SPECTROPHOTOMETRIEàUV

ASPECT DES ARN SUR GEL D'AGAROSE

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 18

MarqueurdePM(1kb)ARN totaux dégradés ARN totaux non dégradés ARN totaux non dégradés

19

1.3.1. Les plasmides: Rappel

1.3.Extraction

splasmi s TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 20 Les plasmides peuvent être élimin és des cellules hôtes=CURAGE (curing)

" Spontané/Induit " Principe: traitements inhibant la réplication des plasmides sans affecter la reproduction des cellules hôtes à Plasmides inhibés progressivement & dilués au cours de la multiplication bactérienne

Méthodes de curage:

" Mutagènes dérivés de l'acridine " Radiations UV ou ionisantes " Privation de thymine " Températures supra-optimales

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 21

Différ nt sform s

'unplasmi

L'axedeladoublehéliced'ADNpeutlui-mêmes'enrouler enunesuperhélicedroiteougauc he.Cetteformesup r nroulé del'ADNjoueunrôlebiologiquetrèsimportant(compaction,stabilité

l'ADN).Unecoupuresur unseul desdeux brinsd'ADNsuperenroulé(f ormeI)déverrouillelasuperhélicitéetpermetlerelâch ementspontanédelamoléculesousforme circulair ouv rt (formeII).Laréparat iondecettecoupureparuneligase produituneforme circulair f rmé (formeIr).Unecoupuresurlesdeuxbrinsd'unemoléculesuperenrouléeoud'unemoléculecirculaire ferméeproduitunemolécul linéair (formeIII).

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 22

1.3.2. Purification par Lyse alcaline

" Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire = noms abrégés: miniprep, midiprep et maxiprep (volume de la culture bactérienne). " Préparation sélective de l'ADN du pl asmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. " Différentes variantes ou améliorations de cette méthode existent " kits commerc iaux (grd nbr) avec petites colon nes de résine chromatographique échangeuse d'ion à améliorer la pureté de l'ADN.

BUT : Extraire de façon rapide l'ADN plasmidique afin de l'analyser avec des enzymes de restriction et élect rophorèse en gel d'agarose. Obtenir plusieurs mg d'ADN partiellement purifié et Réaliser plusieurs digestions enzymatiques pour vérifier un clone, ou établir une carte de restriction.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 23

Dénaturationdel'ADNtotal

Préparation d'ADN plasmidique

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 24

1.3.3. Purification par Gradient de chlorure de césium

= technique basée sur la centrifugation en gradient de densité.

On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un gradient de concentration. la différence entre la densité de la particule et celle du solvant influence la vitesse de sédimentation.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 25

Comment?

Densité de la particule >celle du milieuLaparticulesédimenteDensité de la particule =celle du milieuLaparticulenesédimentepasDensité de la particule TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 26 Purification sur gradient de Chlorure de Césium TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 27

2.Séparation des acides nucléiques

La technique la plus utilisée pour la séparation des acides nucléiques: L'électrophorèse Principe général: Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 28

ELECTROPHORESE DE L'ADN

Cette technique est assez simple à mettre en oeuvre si on dispose des bons outils et de quelques astuces. = technique de biologie moléculaire àséparer des fragments d'ADN de différ entes tailles en les faisant migrer dans un gel en les soumettant à un courant électrique. " Le gel es t constitué d 'une matrice de polymère b aignant dans un tampon conducteur. " Deux princi paux polymères sont utilisés : l'agarose et le polyacrylamide.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 29

Principe: basée sur la sépara tion des acides n ucléiques chargés négativement à pH 7~8, vers l'anode (+) sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel en fonction de la taille des molécules.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 30

Electrophorèse d'ADN

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 31

" L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ; " L'agarose = polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles. En général, de l'agarose de grande pureté à solidification lente est utilisé lorsque l'ADN doit être extrait du gel après migration. Electrophorèse sur gel d'agarose

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 32 Pouvoir de séparati on d'ADN linéai re, double brin, selon la concentration d'agarose du gel TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 33

Le pouvoir de résolution d'un gel d'agarose dépend du % d'agarose. Il peut varier de 0,5 à 2%

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 34

Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets Puits : 1. Ech elle de marqueur de poids moléculaire (1kbplus) 2. vide, 3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée Photographiedugel

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 35

Le bromure d'éthidium (EtBr) = à la fois un agent intercalant et un fluorochrome. Structure aromatique plane à s'intercaler entre les paires de bases à détorsion de la double hélice et émission de lumière (fluorescence) dans le rouge-orange lorsque le complexe ADN-EtBr est excité en lumière utraviolette.

Révélation de l'ADN

La méthode de détection de l'ADN dans les gels d'électrophorèse la plus utilisée est celle au Bromure d'éthidium.

36

" Lalongueurdelamoléculed'ADN:laséparationsefaitenfonctiondupoidsmoléculaireetdoncdelatailledel'ADN." Laconcentrationdugel:l'augmentationdelaconcentrationréduitlavitessedemigrationetpermetlaséparationdefragmentd'ADNdepluspetitetaille." Levoltage:pluslevoltageestimportant,pluslavitessedemigrationaugmente.Toutefoislevoltageestlimitéenintensité(5V/cm):unfortvoltageàaugmentationdetempérature(fondrelegel)." Laconfor mationdel'ADN:l'ADNplasmidique,nondigér épar uneenzymederestriction,migreàdifférentesvitesses(dupluslentauplusrapide):ADNcirculaire,ADNlinéaireetADNsuperenroulé.

Facteurs affectant la migration

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 38

Bande à moindre mobilité à forme relâchée Bande à + forte mobilité à forme superenroulée

Electrophorèse de l'ADN plasmidique

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 39 Formes linéaire, relâchée, super-enroulée TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 40

La carte de restriction (= physique) est une représentation graphique de la lo calisatio n des sites reconnus par les principale s enzymes d e restriction sur une molécule d'ADN.

3.Elaboration de Cartes de restrictions des plasmides

Définitions:

A ne pas confondre avec " Carte génétique »: Représentation graphique de la position des gènes les uns par rapport aux autres sur un génome.

Grâce à une telle carte, il est facile de prévoir la taille des fragments produits par digestion par un e seule ou plusieurs enzymes de restriction.

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 41

Sites reconnus et types d'hydrolyse

TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 42 Utilisation comme marqueur de poids moléculaire TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 43 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D'ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 44quotesdbs_dbs10.pdfusesText_16

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