[PDF] Filière SVI- Semestre 5

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Filière SVI- Semestre 5

2014/2015

U M V FSR

Acquérir les connaissances de base dans le domaine de la biologie moléculaire Se familiariser avec les outils méthodologiques modernes en biologie moléculaire S'initier à déchiffrer une portion d'un génome et de prévoir son expression Etre en mesure d'envisager les changements de la séquence suscep tibles d'influencer l'expression.

Planducours

• Laréplication II.1 • Latranscription • TranscriptionchezlesProcaryotes• TranscriptionchezlesEucaryotes II.2 • Latraduction II.3 • Larégulationgénétiquechezlesbactéries II.4 • Initiationauxtechniquesusuelles debiologiemoléculaire• LeDogmeCentralIII

• Introduction à la biologie moléculaire 1 • Méthodes d'étude des Acides nucléiques (extraction et purification) 2 • Séparation des acides nucléiques et électrophorèse 3 • Endonucléases de restriction 4 • Vecteurs de clonage (plasmides) 5 • Marquage des acides nucléiques 6 • Amplification par PCR 7

Aucroisementdelagénétique,delabiochimieetdelaphysiq ue,labiologiemoléculairees tunedis ciplinescienti@iquedontl'objetestla compréhensiondesmécanismesdefonctionnementdelacelluleauniveaumoléculaire.

1. Introduction à la Biologie Moléculaire Historique

AuXXe siècle,suit eàl'élaborationdesl oisdelagénétique,deladécouvertedes chromosomes etdel'identi@icationdel'ADNcommesupportdel'informationgénétique,estapparueLabiolo giemoléculaire.

BiologieMoléculaire?

Etudedesgènespo rtantl'inf ormationgénétique ,leurstransformationsetleursfonctions.Leterme"biologiemoléculaire»désigneégalementparextensionl'ens embledestechniquesd emanipulationsd'acidesnucléiques (ADN,ARN),appeléesaussitechniquesdegéniegénétique.

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

Quefautilétudier?

Quellessontlesconséquencesdudéveloppementdelabiologiemoléculaire?1. Introduction à la Biologie Moléculaire

RAPPELS:

ADN/ARNSTRUCTURES/FONCTIONS

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

Ø 50%dupoidssecdelaplupartdescellules=protéinesØ Protéine=polymère(chaîne)d'acidesaminés

Ø Chaqueprotéineestcaractériséeparsaséquenced'acidesaminés.

Ex. le lysozyme (126 AA)

RAPPEL

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ü Onconnaîtactuellement~8000protéinesdifférentes.

ü Onendécouvreunecentainedenouvellesparmois.ü Nombretotaldeprotéinesquepeutfabriquerl'organisme

humain=???(quelquechoseentre50000et150000).ü Chaquecellulefabriquelesprotéinesdontelleabesoin. ü Pourfabriqueruneprotéine,ilfautdeuxchoses: • Desacidesaminés. • La"recette»:quelsacidesaminésfaut-ilassembler etdansquelordre? RAPPEL1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ADN="recettes»desprotéines

RAPPEL1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ü CricketWatson,1953

ü Découvertedelastructuredelamoléculed'ADNü ADNetARN=acidesnucléiques ü Lesacidesnucléiques=polymèresdenucléotides RAPPEL1. Introduction à la Biologie Moléculaire ü NUCLÉOTIDE=ose+baseazotée+acidephosphorique

BaseazotéeSucreGroupementphosphate1 2 3 4 5

RAPPEL1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ü Lesbasesazotées:puriquesoupyrimidiques

Uracile

RAPPEL1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ADN:structure

ü ADN=AcideDésoxyriboNucléiqueü Polymèresdenucléotidesreliésentreeuxpardesfonctionsestersü Ose=désoxyriboseü Lesbases:Adénine,Guanine,CytosineetThymineü Sionsépareunemoléculed'ADNennucléotides,onobtienttoujours:A=TetG=Cü Pourquoi?

1 2 3 4 5

Liaison 3OH-5P

5 3

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ADN:structure

ü HypothèsedeCricketWatson:Apeuts'apparieravecTetCavecG:AavecT:deuxliaisonshydrogèneCavecG:troisliaisonshydrogène

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ADN:structure

Ø DonclamoléculedADNestforméede2brinsdenucléotidesØ Cesdeuxbrinsonttroispropriétésessentielles:Ø antiparallèlesØ complémentairesØ hélicoïdaux

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ADNdesdifférentsêtrevivants

ü Danstouslesorganismes:• Supportdelinformationgénétique• Structureendoublehélice(saufcertainsvirus)ü Différences:• NombredemoléculesdADN:1pourE.Coliet46pourlHomme• Longueur:quelquesmilliersdenucléotidesàplusieursmillions• Forme:linéaireoucirculaire• Localisationdanslacellule:séparéounonducytoplasmeparunemembrane• Séquenceenbasesü Virus:génomeslespluspetits(quelquesmilliersdenucléotides)àADNouàARN

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ü Procaryotes:ADNdanslecytoplasmeUnseulchromosome"circulaire»=continuPlusieursmillionsdenucléotidesPrésencedeplasmides=petitsmorceauxdADNcirculaires,indépendantsdelADNprincipalü Eucaryotes:ADNdanslenoyauPlusieurschromosomesavecADNfortementcompactéetlinéairePlusieursmilliardsdenucléotidesADNassociéàdesprotéinesü CasdelADNdesmitochondries:ADNcirculaireCodegénétiquedifférentdelADNnucléaireTransmissionmaternelleuniquement

ADNHistones

ADNdesdifférentsêtrevivants

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

RAPPELProcaryote/Eucaryote

Bactérie

CelluleanimaleCellulevégétale

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

Les3domainesduvivant

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

ARN:structure

Ø ARN=AcideRiboNucléiqueØ PolymèresdenucléotidesreliésentreeuxpardesfonctionsestersØ Ose=riboseØ Lesbases:Adénine,Guanine,CytosineetUracileØ ARN=unseulbrinØ Appariemententre2ARNdifférents,entreunbrind'ADNetunbrind'ARNousurluimême:AavecUetGavecC

OHOHOH12345HOH

2 C

Ribose

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

LesdifférentsARNs:

Ø ARNr=ARNribosomiqueParticipent,aveclesprotéinesribosomiques,àlaformationdesribosomes(moléculesnécessairesàlasynthèsedesprotéines)Ø ARNt=ARNdetransfertTransfertlesacidesaminésverslelieudesynthèsedesprotéinesØ ARNm=ARNmessagersPortentlinformationgénétiquedelADNverslelieudesynthèsedesprotéinesØ ARNsn=ARNsmallnuclearPrésentdanslenoyauuniquementParticipentàlarégulationpost-transcriptionnelle

1. Introduction à la Biologie Moléculaire

• Introduction à la biologie moléculaire 1 • Méthodes d'étude des Acides nucléiques (extraction et purification) 2 • Séparation des acides nucléiques et électrophorèse 3 • Endonucléases de restriction 4 • Vecteurs de clonage (plasmides) 5 • Marquage des acides nucléiques 6 • Amplification par PCR 7

2. Méthodes d'étude des Acides nucléiques (extraction et purification)

Décrire les gestes qui permetten t de réaliser l'extraction et la purification d'ADN génomique. Faire la distinction entre les démarches à suivre en fonction des types d'organismes . Expliquer le principe de l'ex traction d e l'ARN messager en vue de la réalisation d'une banque d'ADNc. Expliquer le principe de dosage des acides nucléiques et le calcul des qu antités d' acides nucléiques à partir des données brutes fournies par un spectrophotomètre.

2.1.Extractiondel'ADN

Différents ADN ADN génomique La totalité de l'ADN à l'intérieur du noyau =ADN nucléaire =ADN chromosomique Différent d : ADN Mitochondrial ADN Chloroplastique ADN Extra-chromosomique (plasmides)

=techniquepermettantd'isolerl'ADNdecellulesoudetissus.L'ADNextrait àdigestion,hybridation(Southernblot),séquençage,PCR,clonage...Différentsprotocolespourextrairel'ADNavecmêmeschémadeprincipe:2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique•Lysedescellules•Eliminationdesprotéines•Eliminationdesautresacidesnucléiques(ARN...)•Concentrationdel'ADNparprécipitationàl'alcool

2.1.Extractiondel'ADN

Différentesvariantesemployées:LADNgénomique es tissudet issu(organisme animalou végétal)Oudecellules(micro-organisme,@luidesbiologiques...)Plusieurstechniquessontutilisées:Kitscommerciauxàextractionsrapidesàl'aidederéactifsprêtsàl'emploi.

Phénol/ChloroformeàADNpur

2.1.Extractiondel'ADN

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

FEUILLESFRAICHES

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

FEUILLESLYOPHILSEES

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

lyse des cellules ou des tissus =broyage ou pas + extraction/détergents • disperser les bicouches lipidiques des membranes • dénaturer les protéines srtt celles associées à l'ADN dans la chromatine déprotéinisation de la solution =extraction / solvants organiques, en général du phénol +/-chloroforme protéines dénaturées à précipité à l'interface phénol-eau = " gâteau » l'ADN en solution dans la phase aqueuse

Pour éliminer les ARNsà Traitement par lARNase.

Solution très visqueuse l'ADN : très longs filaments s'opposant aux écoulements hydrodynamiques.

Préparation d'ADN génomique

LADN collecté/centrifugation à dissous dans Tampon ou Eau pure. précipitation de lADN =addition d'éthanol ou d'isopropanol dans la phase aqueuse

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

33

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

Lapuri@icationd'unesolutiond'ADNsefaitleplussouventparprécipitationsrépétéesdansl'alcool.Unesolutiond'ADN,portéeàhauteforceioniqueparadditiondeNaCl3M(1/10duvolume),estadditionnéed'unlargeexcèsd'éthanolabsoluà-20°C.Aubo utdequelquesminute saumaximum,onvoit apparaîtreunprécipité blanchâtre,translucideet@ilamenteux(la"méduse»)constituédelongs@ilamentsd'ADNprécipité.Onrecueilleceprécipitéparcentrifugationà10000gpendantunquart d'heureenviron. Pourlaverl'ADNonresuspendleprécipitédansdel'éthanolà75%toujoursà-20°C.puisoncentrifugeànouveau.Leculotdecettedernièrecentrifugationestégoutté,puisséchésousvide.Onpeutco nserverl'ADN àsecouleredissoudreimmédiatementsoitdansdel'eaupu restérile,soi tdansuntamponTris-EDTA.Commentaire:

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

GENOMICDNAISOLATIONFROMRICESEEDLINGS

• DNAextractionbuffer - Cellwallandcell • Proteindenaturation - Chloroform/phenol • DNAprecipitation - AbsoluteEthanol • Washing - 70%Ethanol • DNArenaturation - TEbuffer

Exemple1

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

GENOMICDNAISOLATIONFROMDATEPALMSEEDLINGS

• DNAextractionbuffer - Cellwallandcell membranes'disruptionwithCATB&PVPP • Proteindenaturation - Dichloromethane • DNAprecipitation - AbsoluteIsopropanol • Washing - 70%alcohol • DNArenaturation - TEbuffer

Exemple2

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

Kit Qiagen Kit Puregene Phénol/Chloroforme 1 3 2 Quantité/Rendement 2 1 3 Pureté de lextrait 3 2 1 Rapidité 1 2 3 Coût 3 3 1 Sécurité du manipulateur

Comparaison de différentes méthodes:

méthode classique versus kits comerciaux 1= la moins bonne; 3= la meilleure.

2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

RECAPITULATIF

Lextraction/puri[icationdel'ADN=2Etapes:ExtractionàdigestiondestissusetlysedescellulesPuri@icationàséparationdelADNdesa utresconsti tuantscellulaires.2.1.1.Extractiondel'ADNgénomique

40

ü Petitesmoléculesd'ADNdoub lebrin,habituellement circulairesü Alocalisationextrachromosomiqueü Présentschezla plupartdes espècesbactériennes (qqueslevuresetmycètes)

Bactérie

2.1.2.Extractiondel'ADNplasmidique

Lesplasmides:Généralités

41

2.1.2.Extractiondel'ADNplasmidique

Lesplasmides:Généralités

2.1.2.Extractiondel'ADNplasmidique

Lesplasmides:Généralités

43

Différentesformesd'unplasmideL'axedeladoublehéliced'ADNpeutlui-mêmes'enrouler enunesuperhélicedroiteougau che.Cetteformesuperenrouléedel'ADNjoueunrôlebiologiquetrèsimportant(compaction,stabilitédel'ADN).Unecoupuresur unseul desdeux brinsd'ADNsuperenroulé(f ormeI)déverrouillelasuperhélicitéetpermetlerelâch ementspontanédelamoléculesousforme circulaireouverte(formeII).Laréparat iondecettecoupureparuneligase produitunefor mecirculairefermée(formeIr).Unecoupuresurlesdeuxbrinsd'unemoléculesuperenrouléeoud'unemoléculecirculaire ferméeproduitunemoléculelinéaire(formeIII).

44
Lesplasmides peuventêtreéliminés descelluleshôtes=CURAGE(curing)

" Spontané/Induit" Principe:traitementsinhibantlaréplicationdesplasmidessansaffecterlareproductiondescelluleshôtesàPlasmidesinhibésprogressivement&diluésaucoursdelamultiplicationbactérienneMéthodesdecurage:

" Mutagènesdérivésdel'acridine" RadiationsUVouionisantes" Privationdethymine" Températuressupra-optimales

2.1.2.Extractiondel'ADNplasmidique

Lesplasmides:Généralités

45

ü Parmilestechn iqueslespl uscourantesdelabiologiemoléc ulaire=nomsabrégés:miniprep,midiprepetmaxiprep(volumedelaculturebactérienne).ü Préparationsélectivedel'ADNduplasmidecontenudanslesbactéries,toutenéliminantl'ADNduchromosomebactérien.ü Différentesvariantesouaméliorationsdecetteméthodeexistentü kitscommerci aux(grdnbr)av ecpetitesco lonnesderésinechromatographiqueéchangeused'ionàaméliorerlapuretédel'ADN.

BUT:Extr airedefaçonrapidel'ADN plasmidiquea@indel'analyseravecdesenzymesderestrictionetélectrophorèseengeld'agarose.Obtenirplusieursmgd'ADNpartiellementpuri@iéetRéaliserplusieursdigestionsenzymatiquespourvéri@ierunclone,ouétablirunecartederestriction.

46

Dénaturationdel'ADNtotal

=techniquepermettantd'isolerl'ARNdecellulesoudetissus.L'ARNextrai tàhybridation(Northernblot),banquesADNc,RT-PCR...Différentsprotocolespou rextrairelARNavecmê meschémadeprincipe:" Lysecellulair emécanique(congélation,billes decéramiqueoudétergents)ouenzymatique(lysozymeoulalyticase)+ProtectiondesARNdel'actiondesARNases." 2grandsprincipes:1)lesdifférencesdepropriétésphysico-chimiquesARN/protéines;2)l'adsorptionsélectivedesARNsursupportsolide.

2.2.Extractiondel'ARN

Le pyrocarbonate d'é thyle ou diéthyl pyrocarbonate, diéthyl dicarbonate, DEPC, est un composé organique utilisé en biochimie pour sa capa cité à réagir sp écifiquemen t avec les acides aminés histidine et, dans une moindre mesure, tyrosine des protéines. Utilisation en Extraction des ARN Cette particularité permet d'utiliser cette molécule pour inactiver les RNases. Ces protéines sont en effet très résistantes aux agents dénaturants. La réaction avec le DEPC modifie les histidines du site actif de ces enzymes. L'inactivation des RNAses est recommandée au cours d'expériences mettant en jeu des ARNs af in d'éviter le ur dégradation. InhibitiondesARNasesaucoursdel'extractiondesARNs

2.2.Extractiondel'ARN

• La vaissel le de laboratoire peut être déconta minée par trempage dans une solution à 1% de DEPC pendant environ une heure. • L'eau utilisée pour faire les diverses solutions en contact avec les ARN est aussi traitée avec le DEPC. On obtient ainsi de l'eau sans RNases. • Le DEPC n'ayant pas réagi est dégradé en éthanol et dioxyde de carbone par une courte phase de chauffage sous pression à 120 °C dans une autoclave.

Au laboratoire

Ce produit est considéré comme mutagène àA manipuler avec précaution ...

2.2.Extractiondel'ARN

2.2.Extractiondel'ARN

ExtractiondesARNtotaux

Suspensiondel'ARN

Eaupure(RNAsefree)

Précipitationdel'ARN

EthanolAbsolufroids...

Séparationdel'ARN

Chloroforme

Broyage/Homogéneisation

Trizol(pH5)

51

Pourextraire l'ARNd'untissuoud'une suspensiondecellules, ilfautimpérativementinhibertoutetracedARNase.

2.2.Extractiondel'ARN

ExtractiondesARNtotaux

L'homogénéisationdansletubedePottersefaitdansuntamponTris-EDTAenprésencede thiocyanatedeguanidinium4MetdeSDS.Lesdébriscellulairessontsédimentésen10minà10°C.Lesurn ageantcontenantlesacidesnucléiquesest déposésurungradientdedensitécomprenantaufonddutubeunesolutiontrèsdensedeCsCl5,7Msurmontéed'unecoucheintermédiairedeCsCl2,4M.Ce gradientestultracentrifugédurant24heuresà30000tours/minàlatempératureambiante.Onpeuta lorsrecueilli runculotd'ARNde massesmoléculairesélevéesquiserontsoumis àl'extrac tionparlephénole tlechloroforme.

Commentaire:

2.2.Extractiondel'ARN

Puri[icationdesARNm

2.2.Extractiondel'ARN

Puri[icationdesARNm

Après avoir lavé la colonne en milie u alcalin (potasse), on charge les ARN totaux à haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0, 1 M en surv eillant l'absorb ance de l'éluat à 260 nm pour s'assurer de l'élimination des ARN non retenus par la colonne (ARNr, ARNt,... ). Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en abaissant la conce ntration de KCl à 0,01 M et en élevant la température. Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de s'assurer de la qualité de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthèse de cDNA. Commentaire:

2.2.Extractiondel'ARN

Puri[icationdesARNm

2.3.1.SpectresdabsorptiondesacidesnucléiquesLes spectres dabsorption des acides nucléiques présentent une bande dabsorption maximale autour de 260 nm.

Tous les nucléotides ont leur λ

max

autour de 260 nm, valeur qui nest pas affectée par le composant glucidique et le phosphate. 2.3.1.Spectresdabsorptiondesacidesnucléiques

ü Labsorbance à 260 nm peut être mesurée pour estimer la concentration dacide nucléique. 2.3.2. Dosage des acides nucléiques ü Cette estimation est indispensable après extraction dADN à partir dun matériel biologique. ü Pour des dé terminations approximatives de la concentration des acides nucléiques purs, on peut assumer quune solution aqueuse contenant 50 µg/ml dADN double brin ou 25µg/ml dADN simple brin ou 40 µg/ml dARN donne une valeur de A260nm = 1. ü Dosage très sensibl e; on peut desc endre jusquà une concentration massique de 2-3 µg/mL.

ü Labsorbance à la longueur donde caractéristique de 280 nm (i.e. A280nm) est communément utilisée pour estimer la concentration totale de protéines dans un échantillon. ü Les protéines sont des interférents. Il est donc indispensable de mesurer également labsorption à 280 nm. ü Pour des échantillons dADN pur, A260nm/A280nm= 1.8. Un rapport < 1.8 indique la présence de protéines, tandis quun rapport > 1.8 indique la présence dARN. 2.3.2. Dosage des acides nucléiques

• Introduction à la biologie moléculaire 1 • Méthodes d'étude des Acides nucléiques (extraction et purification) 2 • Séparation des acides nucléiques: électrophorèse 3 • Endonucléases de restriction 4 • Vecteurs de clonage (plasmides) 5 • Marquage des acides nucléiques 6 • Amplification par PCR 7

La technique la plus utilisée pour la séparation des acides nucléiques: Lélectrophorèse Principe général: Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour d es charges identiques, en fonction de leur taille.

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

65

Cette technique est assez simple à mettre en oeuvre si on dispose des bons outils et de quelques astuces. = technique de biologie moléculaire à séparer des fragments dADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un gel en les soumettant à un courant électrique. " Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. " Deux principaux polymères sont utilisés : l 'agarose et le polyacrylamide.

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

Principe: basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement à pH 7~8, vers l'anode (+) sous l'effet d'un champ électrique . Cette séparation s'effectue à t ravers la matrice du gel en fonction de la taille des molécules.

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

ü Estimation du poids moléculair e de fra gments d'ADN après une digestion par des e nzymes de restriction ü Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR ü Séparation de fragments dADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot. Lesapplicationsdelélectrophorèsedesacidesnucléiques

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

ü L' agarose est utilisé à des conce ntrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ; ü Lagarose = polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles. En général, de l'agarose de grande pureté à solidification lente est utilisé lor sque l'ADN doit être extrait du gel après migration.

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

Pouvoir de séparation d 'ADN linéa ire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

Le pouvoir de résolution dun gel dagarose dépend du % dagarose. Il peut varier de 0,5 à 2%

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

Le gel dagarose nest pas résolutif pour de petits fragments dADN (Inférieurs à 100 pb)

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets Puits : 1. Echell e de marqueur de poids moléculaire (1kbplus) 2. vide, 3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée Photographie du gel

Lebromure d'éthidium(EtBr)=à la foisunagent intercalantet un@luorochrome.Structurearomatiqueplaneàs'intercalerentrelespairesdebasesàdétorsiondeladoublehéliceetémissiondelumière(@luorescence)danslerouge-orangelorsquelecomplexeADN-EtBrestexcitéenlumièreutraviolette.

C'est l'une des principales méthodes de détection de l'ADN dans les gels d'électrophorèse. Il peut être remplacé par l'ioduredepropidium

Bromured'éthidium

ü préparationaisée,rapide,etpeucoûteusedesgelsd'agaroseü pasdedénaturationdeséchantillonsü l'agaroseplusfermeetmoinstoxiquequelegeldepolyacrylamideü leséchantillons peuventêtrerécupérésenv ued'analysessupplémentaires

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.1.Electrophorèsesurgeld'agarose

ü Lepolyac rylamideestutiliséàdesconcentrations de4%à20%(poids/volume)etpermetdeséparerdesmoléculespluspetitesd'acidesnucléiques.ü Onpeutaussifairevariersaréticulation(tauxderami@ication)lorsdelapoly mérisatio npourmod ulerlesparamètresdeséparation;ü L'acrylamidees tlenomusue ldu2-propénamide(amideacrylique)deformulebruteC

3 H 5

NO.ü Enbiolog iemoléculaire,onutilise l'acrylamidepolymérisé(polyacrylamide)pourréaliserdesélectrophorèses.

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

Efficace pour les petits fragments dADN entre 20 & 2000 paires de bases. (cartographie)

GEL DACRYLAMIDE NATIF (LADN est double brin)

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

Efficace pour les très petits fragments dADN entre 1 & 400 paires de bases. (séquençage) GEL DACRYLAMIDE DENATURANT (LADN est simple brin)

+ agent chaotropique: l'urée

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

ü Lalongueurdelamoléculed'ADN:laséparationsefaitenfonctiondupoidsmoléculaireetdoncdelatailledel'ADN.ü Laconformationdel'ADN:l'ADNplasmidique,nondigéréparuneenzymederestriction,migreàdifférentesvitesses(dupluslentauplusrapide):ADNcirculaire,ADNlinéaireetADNsuperenroulé.ü Laconcentrationdugel:l'augmentationdelaconcentrationréduitlavitessedemigrationetpermetlaséparationdefragmentd'ADNdepluspetitetaille.ü Levoltage:pluslevoltageestimportant,pluslavitessedemigrationaugmente.Toutefoislevoltageestlimitéenintensité(5V/cm):unfortvoltageàaugmentationdetempérature(fondrelegel).

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

3.3.Lesfacteursaffectantlamigration

ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL DAGAROSE

ADN natif non digéré

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

Genomic DNA from 8 blood samples stored at 4°C for 1 week. DNA was purified using the QIAamp DNA Blood Mini Kit. When blood is stored at 4°C the DNA is rapidly degraded due to apoptosis; the resulting apoptotic banding pattern can clearly be seen in these samples. M1: lambda-HindIII; M2:100 bp ladder.

Agarose gel electrophoresis of DNA purified with SpinClean™ Genomic DNA purification Kit. M : 1 kb ladder marker, line 1: Chicken whole blood(20ul sample volume), line 2 : Human whole blood(100ul sample volume), line 3 : E.coli, line 4 : L.brevis, line 5 : Streptomyces hygroscopicus subsp. INTACT DNA SAMPLES DEGRADED DNA SAMPLES

ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL DAGAROSE

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

Vérification de l'integrité de l'ADN

High Quality Genomic DNA

>95% DNA will be of high molecular weight, migrating as intact band near the top of the gel

Very little evidence of smaller fragments

indicated by a smear of many different sized DNA fragments DNA A 260

1.0 50 ug/mL A

260
/ A 280

1.6-1.8 High Purity RNA A

260
1.0 (in water)

40 ug/mL A

260
/ A 280

1.9-2.1

(in 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)

High Purity

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

ASPECT DES ARN SUR GEL DAGAROSE

3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

• Introduction à la biologie moléculaire 1 • Méthodes d'étude des Acides nucléiques (extraction et purification) 2 • Séparation des acides nucléiques et électrophorèse 3 • Endonucléases de restriction 4 • Vecteurs de clonage (plasmides) 5 • Marquage des acides nucléiques 6 • Amplification par PCR 7

.Endoncléasesderestriction .1.Généralités

Cesenzymes, naturellementprésentes chezlesbactéries,sontdevenuesdesoutilsimportantengéniegénétique.

.Endonucléasesderestriction .1.Généralités .Endonucléasesderestriction .2.Nomenclature

Sites = 4 à 6 paires de bases à Coupure fréquente ~ 3kb Sites = 8 paires de bases à Coupure rare ~ 100-200kb

.Endonucléasesderestriction .2.Nomenclature .Endonucléasesderestriction .3.Fragmentderestriction .Endonucléasesderestriction ..Systèmederestriction-modi[ication .Endonucléasesderestriction .Endonucléasesderestriction .6.Exemples .Endonucléasesderestriction .6.Exemples

LaDNase1estuneendonucléasequidégradelADNdoublebrinou simplebrin.Lescoupures ("nicks»)sontcomplètementaléatoiressansspéci[icitédesite.Lesprodu itsdelaréactionson tdes oligonucléotidesquipossèdentungroupementphosphateen5 .Lactivitédépenddesionsbivalents(Mg2+etMn2+)

Autresenzymescoupantl'ADN

LaDNase

La nucléase S1 dégrade lADN simple brin. Nettoie les extrémités simples brins. Coupe un misappariement Sans activité sur le double brin "parfait » Sans activité sur les hybrides ADN/ARN Cette enzyme est extraite dun champignon

Autresenzymescoupantl'ADN

LaNucléaseS1

Ces trois types denzyme ne font pas partie des endonucléases de restriction.quotesdbs_dbs44.pdfusesText_44

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