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DOI:10.1051/rfm/2011008

V. DELATOUR

Développement d"une méthode de référence pour le dosage de la créatinine pour améliorer le diagnostic et le suivi de l"insuffisance rénale

Development of a reference method

for creatinine measurement to improve diagnosis and follow-up of kidney disease

Vincent DELATOUR

1 , Béatrice LALERE 1 , Gilles DUMONT 2 , Jean-Marc HATTCHOUEL 2 , Marc FROISSART3

Jacques DE GRAEVE

3 et Sophie VASLIN-REIMANN 1 1

Laboratoire national de métrologie et d"essais (LNE), 1 rue Gaston Boissier, 75724 Paris Cedex 15, France, vincent.delatour@lne.fr.

2

Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé (AFSSAPS), Départementde l"évaluation externe de la qualité, 143/147 Bd Anatole

France, 93285 Saint Denis Cedex, France.

3

Service de physiologie, Hôpital européen Georges Pompidou, 20 rue Leblanc, 75908 Paris Cedex 15, France.

4

Laboratoire de Biochimie, Centre Hospitalier Rangueil - Larrey Toulouse, 1 avenue du PrJean Poulhès 31059 Toulouse Cedex, France.Résumé

Le dosage de la créatinine représentait le cinquième examen de biologie médicale le plus fréquent en France en 2008. Cette analyse permet d"effectuer le diagnostic et le suivi de la maladie rénale chro- nique, une pathologie grave qui touche environ trois millions de per- sonnes en France. Afin de prévenir l"évolution de l"insuffisance rénale chronique vers le stade terminal de la maladie, il est indispensable de disposer de mesures fiables pour pouvoir établir un diagnostic le plus précoce possible, assurer le suivi et adapter le traitement des patients. Devant ces enjeux considérables de santé publique, l"apport de la métro- logie est nécessaire pour améliorer la fiabilité des analyses et permettre la comparabilité des résultats. Lesméthodes de référence permettent d"une part d"assigner des valeurs de référence aux matériaux d"étalon- nage, une étape indispensable pour établir la traçabilité métrologique des résultats et raccorder ceux-ci au Système international d"unités (SI). D"autre part, les méthodes de référence sont essentielles pour assigner des valeurs de référence aux échantillons de contrôle de la qualité. Elles fournissent ainsi des outils indispensables pour évaluer la justesse des méthodes de routine et celles utilisées par les fabricants de produits de diagnosticin vitropour qualifier les solutions d"étalonnage. MOTS CLÉS: CRÉATININE, MÉTROLOGIE, TRAÇABILITÉ, LA- BORATOIRE DE BIOLOGIE MÉDICALE, ISO 15189, ÉVALUA-

TION EXTERNE DE LA QUALITÉ.

Abstract

In 2008, creatinine measurement was the fifth most common analy-

sis in laboratory medicine in France. Creatinine is the main biomarkerused for the diagnosis, follow-up and monitoring of chronic kidney dis-

ease, a serious pathology that affects approximately three million sub- jects in France. To avoid the evolution of chronic kidney disease to end stage renal disease, it is essential to have reliable creatinine measure- ments in order to allow efficient and early diagnosis. To address these challenges, the contribution of metrology is essential to improve clini- cal measurements reliability and comparability. First, reference meth- ods are necessary to assign reference values to calibration materials. This is the first step to establish the metrological traceability of results to the International system of units (SI) and lead to the standardization of medical analysis. Second, reference methods are essential to assign reference values to quality control samples, providing suitable tools for assessing the accuracy of routine methods and those used by in vitro diagnostic products manufacturers. KEY WORDS: CREATININE,METROLOGY, TRACEABILITY,CLINI- CALLABORATORY,ISO15189, EXTERNALQUALITYASSESSMENT.

1. Introduction

En France comme dans les autres pays industrialisés, la maladie rénale chronique constitue un problème ma- jeur de santé publique [1-3] : il est estimé que deux à trois millions de personnes sont atteintes par cette patho- logieenFrance(26millionsauxEtats-Unis d"Amérique). Le nombre de patients en insuffisance rénale termi- nale est de l"ordre de 65000 et augmente continûment, DÉVELOPPEMENT D'UNE MÉTHODE DE RÉFÉRENCE POUR LE DOSAGE DE LA CRÉATININE ...21

Tableau 1

Les dix analyses de biologie médicale les plus fréquentes en France en 2008 et le coût de leur remboursement par l"Assurance maladie.

Nombre d"analysesMontant remboursé (e)

RangLibelle de l"acte200620072008200620072008

1Hémogramme29 098 23830 273 34131 676 176228 952 472219 891 596230 134 361

2Glucose20 520 76120 972 67321 581 41141 206 22441 987 78943 236 576

3Transaminases13 090 51215 419 07816 301 06061 724 14168 587 15772 619 556

4Vitesse de sédimentation14 337 20014 727 50215 130 96927 825 83928 529 42429 312 210

5Créatinine13 661 66614 389 13415 128 00528 683 14630 125 13731 644 523

6Ionogramme12 591 25813 701 01414 767 32354 592 46359 193 14463 701 738

7Exploration d"une

12 636 31913 315 58013 946 430132 559 011136 915 036120 095 824

anomalie lipidique

8Temps de Quick (en cas de

11 865 01712 483 50513 151 90856 851 70759 885 77363 102 892

traitement par les AVK)

9Protéine C-réactive10 187 55511 161 25512 292 56067 242 07367 332 54774 303 031

10Gamma GT8 195 30910 429 64011 167 15232 751 58341 060 51733 989 173

principalement aux dépens des sujets âgés [4]. Actuelle- ment, environ un tiers des patients atteints d"insuffisance rénale sont diagnostiquésalors qu"ils sont déjà à un stade avancé de la maladie [5]. Le diagnostic précoce de l"in- suffisance rénale est déterminant dans la prise en charge du patient pour prévenir l"évolution de la maladie vers rein ou la mise en épuration extra-rénale du patient [6]. En plus de ces enjeux de santé publique, il est indis- pensable de considérer les enjeux économiques considé- rablesà cette pathologie:le coûtdu traitementde l"insuf- fisance rénale terminale est estimé à 1,5 milliards d"euros par an et représente 2 % de la totalité des dépenses de santé de l"Assurance Maladie au bénéfice de seulement

0,075 % de la population française [1,7].

Pour garantir un dépistage efficace des patients et li- miter les dépenses de santé publique, il est donc néces- saire de pouvoir s"appuyer sur des résultats d"analyse les plus fiables possible. L"apport de la métrologie est indis- pensable : d"une part pour établir la traçabilité métrolo- giquedes résultats et assurer leur comparabilitéet d"autre part pour disposer de contrôles de la qualité permettant d"évaluer efficacement la qualité des méthodes commer- ciales [8-10]. En routine en biologie clinique, la créatinine est le principal biomarqueur utilisé pour le diagnostic de l"insuffisance rénale chronique [1]. La mesure de la concentration de créatinine sérique ou plasmatique mérulaire [11-13]. La mesure de la créatininémie est donc un examen très fréquent, qui représentait en 2008 la cinquième analyse la plus pratiquée en France avec en- viron 15 millions d"actes [14]. Le remboursement de ces examens par l"assurance maladie représentait un coût de

31 millions d"euros (tab.1).

2. Méthodesde dosagede la créatinine:étatde l"art

Il existe différentes méthodes de dosage de la créati- nine, qui peuvent être classées en trois grands groupes :

les méthodes colorimétriques basées sur la réaction deJaffe, les méthodes enzymatiques et les méthodes chro-

matographiques couplées à la spectrométrie de masse. Les techniques colorimétriqueset enzymatiques sont uti- lisées en routine dans les laboratoires de biologie mé- dicale. En revanche, les méthodes par spectrométrie de masse sont beaucoup plus lourdes et coûteuses à mettre enoeuvreet pourcette raison,ellesnesont utiliséesquasi- exclusivement qu"au sein des laboratoires de référence et des laboratoires nationaux de métrologie.

2.1. Méthodes colorimétriques basées sur la réaction

de Jaffe Les méthodes les plus utilisées pour la détermination de la créatininémie reposent sur la réaction de Jaffe. Le principe général de cette méthode consiste à mesurer, à

505 nm, l"intensité de la coloration du complexe rouge-

orangé formé par la créatinine et l"acide picrique en mi- lieu alcalin. En 2009,la quasi-totalité des méthodesrepo- sant sur ce principe effectuent cette mesure non plus en point final mais en cinétique, la vitesse de formation de la coloration étant proportionnelle à la concentration en créatinine dans l"échantillon. Les principaux avantages de cette méthode sont la simplicité de mise en oeuvre et le faible coût des réactifs. Le principal inconvénient de cette méthode est son manquedespécificité [15,16].Jusqu"à20%dusignalco- lorimétrique généré lors des évaluations de sérum ou de plasma peut provenirde substancesendogènesautres que la créatininequi réagissentavec l"acidepicrique.Lespro- téines, le glucose,l"acide ascorbique,les céphalosporines et lesα-céto-acides comme l"acétoacétate et le pyruvate font partie de ces chromogènesnon spécifiques qui inter- fèrent avec la réaction à l"acide picrique et conduisent à une surestimation du résultat. Selon leur concentra- tion, ces composés peuvent provoquer une surestima- tion de 10μmol·L -1

à40μmol·L

-1 de la concentration de créatinine. Au contraire, certains composés comme la bilirubine masquent le développement de la colora- tion, donnant des résultats de créatinine faussement bas et pouvant conduire à une erreur de diagnostic. Certains médicaments peuvent également biaiser les résultats. Il

22REVUE FRANÇAISE DE MÉTROLOGIE n

o

26, Volume 2011-2

apparaît donc que le manque de spécificité de ce type de méthode constitue leur principal inconvénient. Pour corriger le biais induit par les réactions non spé- thodes de correction (" Jaffe » corrigé ou compensé) ont été développées. Celle-ci est basée sur des mesures com- paratives avec une méthode deréférence reposant sur la dilution isotopique associée à la spectrométrie de masse. Ainsi, selon le réactif et l"analyseur concerné, une cor- rection de-26μmol·L -1 ou-18μmol·L -1 est automati- quement effectuée sur les résultats obtenus. Dans la plu- part des cas, cette correction arbitraire du biais induit par les interférents permet d"améliorer la justesse de cette méthode [17,18]. Néanmoins, commela concentration en chromogènes non spécifiques est susceptible de va- rier très fortement d"un échantillon à l"autre, cette ap- proche conduit parfois à des résultats aberrants [19]. Par exemple, la concentration des principaux chromogènes non-créatinine est plus basse chez les nourrissons et les personnesâgéesquechezlespatientsayantservisde base au calcul du facteur correctif. Il en résulte l"obtention de résultats faussement négatifs dans certains cas, du fait de la correction excessive.

2.2. Méthodes enzymatiques

Plusieurs fabricants ont développé des méthodes en- zymatiques pour surmonter le manque de spécificité des méthodes colorimétriques de type Jaffe. On distingue deux classes de techniques enzymatiques : celles qui re- posent sur une détection spectroréflectométriqueet celles mettant en oeuvre une détection spectrophotométrique (dans l"UV ou dans le visible). Le principe de ces tech- niques est identique dans les deux cas et met en oeuvre une cascade de réactions enzymatiquesdont le produitfi- nal contient un chromogène. L"intensité de la coloration de celui-ci est directement proportionnelle à la concen- tration en créatinine. Différentes études ont montré que les méthodes en- zymatiques sont moins sensibles aux interférences que celles reposant sur la réaction de Jaffe et présentent d"ex- cellentes performances en terme de justesse et de fi- délité [15,20-24]. Par ailleurs, elles présentent pour la plupart l"avantage d"être directement raccordées aux mé- thodesde référencereposantsur la dilution isotopiqueas- sociée à la spectrométrie de masse. Jusqu"à présent, les méthodes enzymatiques avaient un prix de revient nettement supérieur aux autres mé- thodes; ce qui a vraisemblablement limité leur utilisa- tion dans les laboratoires d"analyse. Leur coût étant en baisse, la logique voudrait que ces méthodes soient de plus en plus utilisées. Néanmoins, malgré leur utilisation croissante, ces méthodes restent encore assez peu utili- sées, les méthodes colorimétriques restant nettement ma- joritaires (fig.3). Les recommandations des sociétés sa- vantes (Société Française de Biologie Clinique et Société de Néphrologie) déjà publiées [25], ainsi que le rapport

de contrôle de marché de l"AFSSAPS [9,10]entermesde choix méthodologiquesdevraientinfluer en faveur des

méthodes enzymatiques

2.3. Méthodes chromatographiques couplées

àlaspectrométriedemasse

Les techniques chromatographiques couplées à la spectrométrie de masse sont les plus sensibles et les plus spécifiques mais elles nécessitent une étape de prépara- tion d"échantillons longue et fastidieuse. Elles sont coû- teuses, ce qui exclut leur utilisation en routine. Les méthodes de référence validées par le JCTLM (Joint Commitee for Traceability in Laboratory Medi- cine)[26] pour le dosage de la créatinine reposent ex- clusivement sur la dilution isotopique associée à des méthodes chromatographiques couplées à la spectromé- trie de masse (IDMS) : la dilution isotopique associée à la chromatographie enphase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-IDMS) [18,27-32]etla dilution isotopique associée à la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-

IDMS) [29,33].

La dilution isotopique consiste à déterminer la concentration d"un composé donné dansun échantillon en ajoutant une quantité connue d"un analogue du com- posé d"intérêt marqué avec un ou plusieurs isotopes stables ( 2 H, 13 C, 15 N, 18

O...). La mesure du rapport entre

l"intensité du signal de la molécule et celle de la molé- cule marquée permet de déterminer directement le rap- port de quantité de matière entre les deux molécules et donc de déduire la concentration du composé. De ce fait, la dilution isotopique associée à un protocole métrolo- gique adapté est une méthode primaire de haute exacti- tude. Elle permet de s"affranchirdes effets de matrice et a démontré d"excellentes performances en termes de répé- tabilité et de spécificité, permettant ainsi d"obtenirde très faibles incertitudes.

3. Développement et validation d"une méthode

de référence pour le dosage de la créatinine L"objectif est de développer et valider une méthode de référence pour le dosage de la créatinine sérique car il n"en existe pas au niveau national. Cette méthode doit permettre un dosage fiable pour des concentrations phy- siologiques de créatinine mais également pour les va- fisance rénale.

3.1. Principe général de la méthode

Le protocole retenu est une adaptation de la méthode de référence mise au point par L. Siekmann et ses col- laborateurs [27]. Les différentes étapes du protocole sont illustrées dans la figure1et ont chacune fait l"objet d"op- timisations. À un échantillon de sérum contenant une quantité in- connue de créatinine est ajoutée une quantité connue de créatinine marquée par des isotopes stables ( 13 Cet 15 N). DÉVELOPPEMENT D'UNE MÉTHODE DE RÉFÉRENCE POUR LE DOSAGE DE LA CRÉATININE ...23 Fig. 1. -Les différentes étapes de la méthode de détermination de la créatinine par ID-GC/MS. La créatinine et son homologuemarqué doiventêtre déri- vés car ces composés ne sont pas suffisamment volatiles pour être analysés directement par chromatographie en phase gazeuse. Comme la créatine (qui est le précurseur non cyclique de la créatinine) forme le même dérivé que la créatinine(mêmesionscaractéristiques),la créatineest un interférant qui doit être éliminé avant l"étape de dé- rivation [29,34]. La purification de la créatinine se fait par colonne échangeuse d"ions. La fraction contenant la créatinine purifiée est évaporée car l"étape de dérivation qui suit doit avoir lieu en l"absence totale d"eau. Le mé- lange de dérivation est injecté directement dans le chro- matographe pour séparer les composés. La détection se fait par spectrométrie de masse avec ionisation par im- pactélectroniqueetpermetdemesurerle rapportentreles aires des pics des ions caractéristiques de la créatinine et de son homologue marqué. Le rapport des aires des pics de la créatinine et de la créatinine marquée est comparé avec celui obtenu en analysant des étalons contenant des quantités connues de créatinine et de créatinine marquée avec la régression linéaire comme modèle d"étalonnage. La quantité de créatinine marquée introduite initialement dans l"échantillon étant connue, cela permet de détermi- ner la quantité de créatinine contenue dans celui-ci.

3.2. Préparation des échantillons

Pour mettre en oeuvre la dilution isotopique, il est re- commandé d"introduireune quantité de composé marqué proche de celle du composé non marqué contenu dans l"échantillonà analyser(exactmatchingisotopedilution). Dans le cas présent, cette quantité a été fixée à 1,2μg. La première étape de la préparationde l"échantillon consiste à prélever le volume de sérum contenant 1,2μg de créa- tinine, ce qui nécessite un pré-dosage. Une solution mère de créatinine [ 13 C; 15 N 2 ] (Icon Isotopes, taux de mar- quage 99,99 %) (créatinine marquée) est préparée gra- vimétriquement de manière à ce que sa concentrationsoit voisine de 110μmol·L -1 . Typiquement, le volume de créatinine marquée ajoutée au sérum est de l"ordre

100μL. Le pH est ensuite ajusté à 4,2 en ajoutant 100μL

de solution tampon composée d"acétate de sodium et d"acide acétique à 50 mmol·L -1 puis un volume d"HCl

à0,1mol·L

-1 correspondant à la moitié du volume dequotesdbs_dbs5.pdfusesText_10

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