[PDF] MODÉLISATION DYNAMIQUE DE CULTURES DE CELLULES CHO

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UNIVERSITÉifiDEifiMONTRÉALifi

ifi ifi ifi MODÉLISATION DYNAMIQUEifiDEifiCULTURESifiDEifiCELLULESifiCHOifi

ALIMENTÉEifi

ifi ifi

JULIENifiROBITAILLEifi

ifi ifi ifi

MÉMOIREifiPRÉSENTÉifiENTION ifi

(GÉNIEifiCHIMIQUE)ifi

AVRILifi2015ifi

ifi ifi ifi ifi ifi

UNIVERSITÉifiDEifiMONTRÉALifi

ifi ifi ifi ifi ifi

Ceifimémoireifiintituléifi

ifi ifi ifi e :ifiMaîtriseifièsifisciencesifiappliquéesifi aifiétéifi :ifi iiiifi ifi

REMERCIEMENTSifi

J'aimerais tout d'abord débuter en remerciant le Pr. Mario Jolicoeur qui m'a proposé mon sujet de

rechercheifi pourifi ceifi mémoireifi etifi quiifi m'aifi encadréifi etifi guidéifitoutifi auifi longifi deifi ceifi parcours.ifi Merciifi

J'aimeraisifi égalementifi remercierifi Jingkuiifi Chenifi quiifi m'aifi énormémentifi aidéifi pourifi laifipartieifi

etifileursificonseils.ifi projetifiquiifiseifitermine.ifi ivifi ifi

RÉSUMÉifi

La production d'anticorps monoclonaux par culture de cellules de mammifèresifiestifiuneifi

niveauxifi deifi productivitéifi etifi deifi reproductibi . En uneifisérieifideifiguidépar desifiplansifiexpérimentauxifi Toutefois, l'analyseifiduifimétabolismeificellulaireifietifil'optimisationifi

dunifiprocédéifi nécessitentifiidéalementifidesifi outilsifi quiifi sontifi àifi laifi foisifi descriptifsifi etifi prédictifs,ifi

. C'estifidansificetteifioptiqueifideifidéveloppementifid'unifimodèleifi

etifianalysé.ifiCeifimodèleifiutiliseificommeifientréesifiuniquementifilesificonditionsifiinitialesifid culture,ifi

c'est-à-direifi lesifi concentrationsifiinitialesifiextracellulairesifi etifi intracellulairesifienifinutrimentsifi etifi

Unifi telifi modèleifi dynamiqueifi devraitifi égalementifi permettreifi deifi simulerifilesifinombreuxififluxifi

métaboliquesifienifi jeu.ifi Leifi modèleifi estifi baséifi surifi laifi descriptionifi desifi fluxifi métaboliquesifi parifi desifi

équationsifi représentantifi desifi mécanismesifi biochimiquesifi connusifi etifi surifi laifi duifi

deifi laifi cellule.ifi Leifi modèleifiaifi étéifiadaptéifiàifi partirifideifi travauxifi précédentsifi deifi modélisationifi duifi

métabolismeificellules CHO,ifietifiaifiétéificonstruitifideifimanièreifiàifipouvoirifisimulerifi

vifi ifi Afinifidstructure (i.e.ifiréseauifimétabolique)ifiduifimodèleifi

quatreifi culturesifi enifi bioréacteurs.ifi Cesifi culturesifi ontifi étéifi effectuéesifienifi utilisantifideuxifi milieuxifi

différents,ifi uneifi cultureifi enifi modeifi cuvéeifi etifi uneifi cultureifi enifi modeifi cuvéeifi alimentéeifi pourifi chaqueifi

milieu.ifi Uneifi analyseifi deifi sensibilitéifi aifi étéifi effectuéeifi pourifi identifierifi lesifi 20ifi paramètresifi lesifi plusifi

métaboliquesifioùifi lesifi paramètresifi lesifi plusifi importants.ifi L'exerciceifi d'optimisationifi aifi étéifi

comparéifile de simulation des quatre cultures, soit enifidivisantificesifidernièresifienifideuxifi

phasesifi

chacune des culturesifisansifichangementifideifiparamètres.ifiEnifioutre,ifil'analyseifidesififluxifimétaboliquesifi

cultures,ifi ouvrantifi laifi voieifi pourifi desifi applicationsifiutilesifiàifi laifi planificationifi d'expérienceifi etifiàifi

viifi ifi

ABSTRACTifi

The productionifi ofifi monoclonalifi antibodyifi(mAb)ifibyifimammalianifi cellifi cultureifiisifi nowifiaifiwellifi

currentifi productionifi bioprocessesifireachingifihighifi productivityifiwhileifimaintainingifihighifi cellifi

bioprocessifi productivityifi andifireproductivityifilevelifivaryifi amongifi biosystems.ifiIndeed,ifianifi efficientifi

theifipresentifimastersifithesis wasifitoifiproposeifiaifimathematicalifimodelifithatifisatisfiesifithoseificriteria.ifi

andifichallengedifi withifi experimentalifi data.ifi Theifimodel,ifihavingifiasifionlyifiinputifi theificultureifiinitialifi

antibodyifiproductionifiasifi wellifi asifi metabolicifi fluxifidynamics.ifi Theifi modelifiincludesifitheifikineticifi

descriptionifi ofifi theifi metabolicifi fluxifiratesifibyifi equationsifiderivedifi fromifiknownifi biochemicalifi

mechanisms,ifiandifimassifi balancesifi basedifi onifitheifistoichiometryifiofifi theifi cell'sificentralifi carbonifi

metabolismifiincludingifi glycolysis,ifi TCAifi cycle,ifi pentoseifi phosphateifi pathwayifi aminoifi acidifi

furtherifi developmentififromifi previousifi workifionifitheifimodelingifiofifi anotherifiCHOificellifiline.ifiItifiisifi

viiifi ifi

distinctifi dataifisubsetsifisuchifi asifibatchifiorififed-batchifi culturesifionly,ifiandifi forifieachificultureifi media.ifi

mediumifi compositionifi orifi theifibatchifi andififed-batchifi strategy.ifi Similarificonclusionificanifi beifidrawnifi

thusificonfirmsifitheifiapplicabilityifiofifitheifidynamicifimodelifiasifianifiin silico platformifitoifistudyifidifferentifi

viiiifi ifi

TABLE DESifiMATIÈRESifi

TABLE DES MATIÈRESifi.........................................................................................................ifiVIII

LISTE DES TABLEAUXifi.............................................................................................................ifiXI

LISTE DES FIGURESifi.................................................................................................................XII

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONSifi.............................................................................ifiXIII

LISTE DES ANNEXESifi............................................................................................................ifiXVII

CHAPITRE 1 REVUE DE LITTÉRATUREifi.............................................................................ifi5

1.1 Production d'anticorps monoclonaux par cellules CHOifi..................................................ifi5

1.1.1 Production d'anticorps monoclonaux à l'échelle industrielleifi......................................ifi5

1.1.2 Utilisation des cellules CHO commeifiplateformeifideifiproductionifi................................ifi8

1.1.3 Modes de cultureifi.......................................................................................................ifi12

1.1.4 Stratégies d'alimentation employées pour le mode cuvée alimentéeifi........................ifi15

1.2 Métabolisme des cellules de mammifèresifi......................................................................ifi19

1.2.1 Survol de la physiologie des cellules CHOifi...............................................................ifi20

1.2.2 Voies du métabolisme central du carboneifi................................................................ifi22

1.2.3 Métabolisme énergétiqueifi..........................................................................................ifi28

1.2.4 Régulation du métabolismeifi.......................................................................................ifi32

1.3 Approches de modélisation du métabolismeifi..................................................................ifi34

1.3.1 Approches de modélisation des vitesses réactionnelles des flux métaboliquesifi........ifi34

1.3.2 Méthodes d'analyse du métabolismeifi.........................................................................ifi38

ixifi ifi

1.3.3 Approches de modélisation des cultures en mode cuvée-alimentéeifi.........................ifi42

CHAPITRE 2 ARTICLE 1: A SINGLE DYNAMICifi METABOLICifi MODELifi CANifi

2.1 Présentation de l'article...................................................................................................ifi45

2.2 Abstractifi..........................................................................................................................ifi46

2.3 Introductionifi....................................................................................................................ifi46

2.4 Material and Methodsifi.....................................................................................................ifi48

2.4.1 Culturesifi.....................................................................................................................ifi48

2.4.2 Analytical methodsifi...................................................................................................ifi50

2.4.3 Model structureifi.........................................................................................................ifi51

2.4.4 Mathematical descriptionifiofifitheififluxesifi.....................................................................ifi53

2.4.5 Sensitivity analysisifi....................................................................................................ifi54

2.4.6 Parameter estimation and confidence intervalsifi.........................................................ifi55

2.5 Results and Discussionifi...................................................................................................ifi56

2.5.1 The culture medium is a primary factor in cell culture behaviourifi............................ifi56

2.5.2 Sensitive parameters are of glycolysis regulation, the energetic metabolism and

58

2.5.3 A single set of parametersifi allowsifi describingifi cellifi behaviourifi forifi variousifi cultureifi

2.5.4 A single set of parameters allows describing exponential and plateau growth phases

ifi64

2.5.5 Fed-batchificultureifimodeifienablesifimaintainingificellifimetabolicifiactivityifi.......................ifi67

2.5.6 Fed-batchificultureificonditionifienhancesifitheifistabilityifiofifimetabolicififluxifiratios.............ifi70

2.5.7 Amino acids metabolism limits growth in the latter phasesifiofifitheificultureifi...............ifi72

xifi ifi

2.6 Conclusionifi......................................................................................................................ifi74

2.7 Acknowledgmentifi...........................................................................................................ifi74

2.8 Referencesifi......................................................................................................................ifi74

2.9 Supporting informationifi..................................................................................................ifi80

CHAPITRE 3 DISCUSSION GÉNÉRALEifi...........................................................................ifi102

3.1 Effets du milieu et de l'alimentation sur les résultats obtenusifi.....................................ifi102

3.2 Structure du modèle adaptée au mode cuvée alimentéeifi...............................................ifi104

3.3 Validité du modèleifi.......................................................................................................ifi106

ifi xiifi ifi

LISTE DES TABLEAUXifi

Tableau 1.1: Composition typique d'une cellule de mammifèreifi....................................................ifi22

Tableau 1.2: Rendement en ATP des coenzymes réduites par les réactions cataboliquesifi.............ifi31

Tableau 1.3: Rendement énergétique des différentes voies métaboliquesifi.....................................ifi31

Tableau 1.4: Équations d'inhibition et d'activationifi........................................................................ifi36

Tableau 1.5: Équations du taux de croissance spécifiqueifi..............................................................ifi37

Tableau 2.1: Sensitivity analysis for the selected parametersifi........................................................ifi59

Tableau 2.2: Reactions of the metabolic modelifi.............................................................................ifi83

Tableau 2.3: Kinetic rate equationsifi................................................................................................ifi85

Tableau 2.4: State variableifiandifiinitialificonditionsifi..........................................................................ifi89

Tableau 2.5: Parameter valuesifi.......................................................................................................ifi91

Tableau 2.6: Parameter values for the 20 most sensitive parameters forifi differentifi mediaifi andifi

Tableau 2.7: Parameter values for the most sensitive parameters for different growth phasesifi.....ifi98

Tableau 2.8: Metabolic fluxes at 48 and 96 h (Batch cultures)ifi......................................................ifi99

Tableau 2.9: Metabolic fluxes at 48 and 96 h (Fed-batchificultures)ifi.............................................ifi100

Tableau 2.10: Metabolic flux ratios at 48 and 96 hifi......................................................................ifi101

Tableau 3.1: Compositions initiales des milieux de cultureifi.........................................................ifi103

xiiifi ifi

LISTE DES FIGURESifi

Figure 1.1 Structure d'un anticorpsifi..................................................................................................ifi6

Figure 1.2 Culture en mode cuvée et cuvée alimentéeifi...................................................................ifi13

Figure 1.3 Cultureifienifimodeifiperfusionifi............................................................................................ifi14

Figure 1.4 Compartimentation de la celluleifi...................................................................................ifi20

Figure 1.5 Métabolisme central du carboneifi...................................................................................ifi23

Figure 1.6 Résumé de la glycolyseifi.................................................................................................ifi24

Figure 1.7 Cycle des acides tricarboxyliquesifi.................................................................................ifi26

Figure 1.9 Régulation de la glycolyseifi............................................................................................ifi33

Figure 1.10 Activation non essentielleifi...........................................................................................ifi36

Figure 1.11 Exemple d'analyse des flux métaboliquesifi..................................................................ifi39

Figure 2.1 Metabolic network described by the model.ifi.................................................................ifi52

Figure 2.2 Experimental and model simulation results for cells and major extracellular

Figure 2.3 Experimental and model simulation results for major extracellularifiaminoifiacids.ifi........ifi58

Figure 2.4. Experimental and model simulation results for major intracellular components.ifi.......ifi62

Figure 2.5. Parametersifiestimatesifiwithificonfidenceifiintervalsififorifidifferentifimediaifiandificultureifimodes.

Figure 2.6. Parameters estimates with confidence intervals for different growth phases.ifi.............ifi65

Figure 2.7. Model simulation of metabolic fluxes.ifi........................................................................ifi68

Figure 2.8. Model simulations of the metabolic ratios.ifi..................................................................ifi71

Figure 2.9. Experimental and model simulation results for intracellular nucleotides.ifi...................ifi80

Figure 2.10. Experimental and model simulation results for intracellular metabolitesifi.................ifi81

Figure 2.11. Experimental and model simulation results for extracellular amino acidifi.................ifi82

xiiiifi ifi ifi

LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONSifi

ACCOAifiAcétylifiCoenzymeifiAifi

ADPifiifiAdénosineifidiphosphateifi

AKifiifiAdénylateifikinaseifi

AKGifiifiAlpha-cétoglutarateifi

ALAifiifiAlanineifi

AMPifiifiAdénosineifimonophosphateifi

ARGifiifiArginineifi

ASNifiifiAsparagineifi

ASPifiifiAspartateifi

ATPifiifiAdénosineifitriphosphateifi

CHOifiifiChinese Hamster Ovary

CITifiifiCitrateifi

CSifiifiCitrateifisynthaseifi

EGLCifiifiGlucoseifiextracellulaireifi

EGLNifiifiGlutamineifiextracellulaireifi

EGLUifiifiGlutamateifiextracellulaireifi

xivifi ifi

FBAifiifiFlux BalanceifiAnalysis

FDAifiifiFood and Drug Administrationifi

F6PifiifiFructose-6-phosphateifi

G3PifiifiGlyceraldehyde-3-phosphateifi

G6PifiifiGlucose-6-phosphateifi

GLCifiifiGlucoseifi

GLNifiifiGlutamineifi

GlnTifiifiGlutamineifisynthétaseifi

GLUifiifiGlutamateifi

GLYifiifiGlycineifi

HISifiifiHistidineifi

ILEifiifiIsoleucineifi

LACifiifiLactateifi

LYSifiifiLysineifi

mAbifiifiMonoclonal antibody

MCAifiifiMetabolic Control Analysis

MFAifiifiMetabolic Flux Analysis

MALifiifiMalateifi

MLDifiifiMalateifidéhydrogénaseifi

MTXifiifiMéthotrexateifi

xvifi ifi NAD+ ifiNicotinamideifiadénineifidinucléotideifi(formeifioxydée)ifi NADP+ Nicotinamideifiadénineifidinucléotideifiphosphateifi(formeifioxydée)ifi

OXAifiifiOxaloacétateifi

PCifiifiPyruvateificarboxylaseifi

PEPifiifiPhosphoenolpyruvateifi

PHEifiifiPheynylalanineifi

PFKifiifiPhosphofructokinaseifi

PGIifiifiPhosphoglucoseifiisom.raseifi

PGKifiifiPhosphoglycérateifikinaseifi

PKifiifiPyruvateifikinaseifi

PROifiifiProlineifi

PYRifiifiPyruvateifi

R5PifiifiRibose-5-phosphateifi

SERifiifiSerineifi

SUCifiifiSuccinateifi

TCAifiifiAcidesifitricarboxyliquesifi

TKifiifiTranskelotaseifi

TYRifiifiTyrosineifi

xviifi ifi

VALifiifiValineifi

X5PifiifiXylose-5-phosphateifi

xviiifi ifi

LISTE DES ANNEXESifi

ifi 1ifi

INTRODUCTIONifi

Les produitsifibiopharmaceutiquesifiseifidistinguentifidesifimoléculesifipharmaceutiquesificlassiquesifiparifileifi

fabricationifi deifi moléculesifi complexesifi quiifi nécessiteraientifi unifi nombreifi d'étapesifi deifisynthèseifi tropifi

dèsifi 1973ifi(Cohenifi etifi al.,ifi 1973)ifi,ifi

éventuellementifiapprouvéeifi parifi laifi FDA.ifiChezifi lesifi cellulesifi eucaryotes,ifi cesifi techniquesifi deifi

aifi étéifi leifi t-PAifi(tissueifi plasminogenifi activator) (Kaufmanifi etifi al.,ifi 1985),ifi quiifi aifi été,ifi enifi 1987,ifi laifi

(mAb), quiifireprésenteifiaujourd'huiifilaificlasseifideifiprotéinesifirecombinantesifiayantifileifiplusifigrandifisuccèsifi

(Walsh,ifi2010).ifiifi

L'arrivéeifisurifileifimarchéifideificeifitypeifideifimoléculeifiextrêmementificomplexeifi leifi

grandeifimajoritéifilesificellulesifideifimammifère.ifiCependant,ifi 1980)ifilaifiproductivitéifidesifi

annéesifi quiifi ontifi suiviifi afinifi d'atteindreifi desifi niveauxifi deifi productionsifi dépassantifimaintenantifi

généralement,ifi maisifi pasifi systématiquement,ifileifi grammeifi parifi litreifi(Kelley,ifi 2009).ifiD'uneifi part,ifi

2ifi ifi

milieuxifi deifi cultureifi sansifi sérumifibovin,ifi sourceifi deifi facteursifi deifi croissance,ifietifi l'optimisationifi desifi

contraintesifiissuesifi desifi augmentationsifi deifi densitéifi cellulaire.ifiEnifi effet,ifi lesifi sous-produitsifi duifi

des ressources nutritionnelles.ifi Ilifi estifi possibleifi enifi effetifi d'opérerifi àifi deifi bassesificoncentrationsifi deifi

d'ammonium.ifi

mammifèreifi quantifi àifi laifi compréhensionifi deifi leurifi métabolisme.ifi L'analyseifi desifi fluxifi métaboliquesifi

Cesifi méthodesifi permettentifi dles flux métaboliques des cellules et leur répartitionifiparifi

rapportifi auxifi diversifi voiesifi métaboliquesifiactivesifidansifi uneifi cellule.ifiCependant,ificesifi techniquesifi

nécessiteifi deifi diviserifilaifimodélisationifi de culture selon les phases de croissances. La

3ifi ifi

extracellulairesifin'aifipasifiencoreifiétéifiappliquéeifiafinifiddifférentes stratégiesifideificulture.ifiUnifitelifi

développementifietifil

Objectifsifietifiméthodologieifi

L'objectififipremierifideifi ceifi projetifiaifi consistéifi àifidémontrerifilaifipossibilitéifid'utiliserifi unifi modèleifi

culture,ifiafinifi deifi comparerifi différentesifi stratégiesifi deifi culture.ifi Ainsi,ifiunifi modèleifi développéifi

l'utilisation de différents milieux de cultures, impliquantifidesifi

conditionsifi initialesifidifférentes,ifietifidesifistratégiesifi d'alimentationifi deifi typeifi cuvée-alimentée,ifi

partie.ificalibration duifimodèleifisurifidifférentsifimilieuxifietifipourifidesificulturesifienifi

modeificuvéeifietificuvée-alimentéeifivisaitifiàifiévaluerifil'étendueifimodèle. Deifiplus,ifi

d'évaluerifi laifi performanceifi duifi modèleifi sousifi différentesifi conditionsifi deifi milieuxifi etifi deifi stratégiesifi

d'alimentation.ifi

Organisation du mémoireifi

Le corps duifimémoireifiestifidiviséifienifitroisifichapitres.ifiLeifipremierifichapitreifiestificonsacréifiàifiuneifirevueifideifi

d'anticorpsifi monoclonauxifiàifi l'échelleifiindustrielle,ifi lesifi caractéristiquesifi deificetteifiplateformeifi deifi

4ifi ifi

décrireifilesifi vitessesifi deifiréactionifibiochimiquesifi etifi pourifi quantifierifi lesifi fluxifi métaboliquesifi serontifi

passésifienifirevue.ifiLeifisecondifichapitreifiseraificonstituéifid'unifiarticleifisoumisifiàifiPLOS Computational

Biology intituléifi"AifiSingleifiDynamicifiMetabolicifiModelifiCanifiDescribeifimAbifiProducingifiCHOifiCellifi

BatchifiandifiFed-batchifiCulturesifionifiDifferentifiCultureifiMedia». Ceifichapitreifiprésenteifilesifiprincipauxifi

métaboliqueifi développéifi et,ifi finalement,ifil'analyseifi desifi principauxifi résultatsifi obtenus.ifi Unifi dernierifi

chapitreifiprésenteraifilaifidiscussionifigénéraleifisurifil. Finalement, le 5ifi

CHAPITRE 1 REVUE DE LITTÉRATUREifi

Dans le présent chapitre, une revue de la littérature portera principalement sur la modélisation de

culturesifi enifi modeifi cuvéeifi alimentéeifi deifi cellulesifi CHO.ifiToutifi d'abord,ifi ilifi seraifi questionifi deifi laifi

productionifi d'anticorpsifi monoclonauxifi parifi lesifi cellulesifi CHO,ifi desifi différentsifi modesifi deifi culturesifi

utilisés,ifietifiduifi choixifi deifi cesifi cellulesifi commeifi plateformeifi deifi productionifi enifi lienifi avecifi lesifi

permettant deificalculerifilesififluxifimétaboliquesifiserontificouvertes,ifiainsiifiqueifilesifiapprochesifiutiliséesifi

1.1 Production d'anticorps monoclonaux par cellules CHOifi

La productionifiàifigrandeifiéchelleifid'anticorpsifimonoclonauxifiàifidesififinsifithérapeutiquesifiestifisommeifi

2010,ifi 13ifi desifi 25ifi nouveauxifi produitsifi biopharmaceutiquesifi approuvésifi parifi laifi FDAifi étaientifi desifi

rythmeifi comparableifi(Butler,ifi 2005).ifi L'améliorationifi deifi laifi productivitéifi parifi l'optimisationifi desifi

1.1.1 Productionifid'anticorpsifimonoclonauxifiàifil'échelleifiindustrielleifi

La production d'anticorpsifimonoclonauxifiàifil'échelleifiindustrielleifiseifidérouleifienifiplusieursifiétapes.ifiLeifi

d banqueifimaîtresseifideificellules,ifipuisifiparifil'expansionifideifilaifipopulationificellulaireifiparifiuneifisérieifi

deifi culturesifi successivesifi jusqu'àifi atteindreifi laifi plateformeifi bioréacteurifi deifi production,ifi pouvantifi

6ifi ifi

représenterifi plusieursifimilliersifi deifi litres.ifi Unifi cycleifi deifi productionifi seifi termineifi parifi l'étapeifi deifi

Bonnes Pratiques de Fabrications (BPF) pour pouvoir être approuvé pour la vente, et doit

permettreifi uneifi productionifi reproductibleifi deifi protéinesifi toutifi enifi conservantifi leurifi efficacitéifi

thérapeutique.ifi

Les anticorps sont des protéines d'environ 150ifikDaifienififormeifideifi"ifiYifi»ififorméesifideifideuxifichaînesifi

cetteifi dernièreifi catégorie,ifi elle-mêmeifi subdiviséeifi deifi IgG1ifi àifi IgG4,ifi estifi laifi plusifi utiliséeifi pourifi laifi

abondanteifinaturellement.ifiLeifihautifideifil'anticorps,ifilaifisectionifiFabifi(anti-bindingififragments), est une

sectionifi comprenantifi uneifi régionifi quiifi permetifi laifi reconnaissanceifi enifi seifi liantifispécifiquementifi àifi

laifisectionifiFcifi(fragmentificrystallizableifiregion), peut se lier à d'autres protéines, tels les récepteurs

ifi 7ifi ifi

tendentifi àifi êtreifi malifi repliées,ifi biologiquementifi inactivesifiouifi génèrentifi desifi effetsifi secondairesifi

indésirables,ifietifi sontifi rapidementifi éliminéesifi parifi l'organismeifi(J.ifi Zhang,ifi 2010).ifi Laifi qualitéifi deifi

productionifidoitififaireifienifisorteifideifis'assurerifiqueificeifiprofilificorrespondeifiàificeluiifirecherchéifietifi estifi

enififorme.ifi

La capacité du domaine variable des anticorpsifi monoclonauxifi àifi seifi lierifi àifi diversifi récepteursifi etifi

substancesifi expliqueifi leurifi grandifi potentielifi d'unifi pointifi deifi vueifi thérapeutique.ifi Lesifi anticorpsifi

cellulesifi tumorales.ifiEntreifi autres,ifi ilsifi peuventifi identifierifi lesifi cellulesifi tumoralesifi etifi induireifi leurifi

apoptoseifiparifil'intermédiaireifiduifisegmentifiFcifiquiifiestifi reconnueifiparifileifisystèmeifiimmunitaire.ifi Ilsifi

effectuerifi desifi diagnostiques.ifi Leursifi multiplesifi usagesifi expliquentifi laifidemandeifi pourifi ceifi typeifi deifi

produit.ifi

contrôléifiparifiajoutifideifiCO2 et/ouifideifiNaOH,ifilaifitempératureifiestificontrôléeifigénéralementifiàifi37ifidegrésifi

8ifi ifi

protéineifi A,ifi suiviifi typiquementifi d'uneifi chromatographieifi parifi échangeifi d'anionifi etifi uneifi

utiliséesifi produisentifi généralementifi entreifi 20ifi etifi 80ifipg/cellule/jourifi d'anticorpsifi(Wurm,ifi 2004;ifiJ.ifi

culture.ifi Plusifi particulièrement,ifi l'optimisationifi desifi composantesifi duifi milieuifi deifi cultureifi etifi

1.1.2 Utilisation des cellules CHO comme plateforme de productionifi

Étant donné leur complexité, les anticorps monoclonaux ne peuventifiêtreifiproduitsifiparifilesifiprocédésifi

produits par des cellules de mammifère. D'une manière plus générale, 32 des 58 produitsifi

biopharmaceutiquesifi approuvésifi enifi 2010ifi étaientifi produitsifi parifi desifi lignéesifi cellulairesifi deifi

9ifi ifi

1.1.2.1. Caractéristiques des cellules CHOifi

Bien que l'usage des hamsters de Chine àifidesififinsifideifirechercheifidateifiduifidébutifiduifi20èmeifisiècle,ifilaifi

premièreifi cultureifi deifi cellulesifi deifiChinese Hamster Ovaries

ellesifi ontifiainsiifiétéifigénéralementifiutiliséesifi pourifi devenirifi leifi modèleifi d'étudeifi desifi cellulesifi deifi

mammifèresificommeifiEscherichiaificoli l'estifipourifilesifibactériesifi(Jayapal,ifietifial.,ifi2007).ifiDeuxifimutantsifi

lignéesifiBabyifiHamsterifiKidney (BHK-21)ifietifideifiHuman Embryonic Kidney (HEK-293)ifisontifisurtoutifi

élevéeifitelleifi qu'expliquéeifi précédemment,ifi uneifi capacitéifi àifi effectuerifi desifi modificationsifi post-

ans.ifi Ilifi s'agitifi d'unifi hôteifi trèsifi sécuritaire,ifi laifiplupartifidesifi virusifi pathogènesifi pourifi l'hommeifi neifi seifi

répliquantifi pasifi dansifi lesifi culturesifi CHOifi(Bandaranayake,ifi etifi al.,ifi 2014).ifi Uneifi vasteifi quantitéifi

10ifi ifi

(Xuifi etifi al.,ifi 2011).ifi Finalement,ifi ilifi estifi relativementifi aiséifi deifi développerifi rapidementifi uneifi lignéeifi

cesificonditionsifi deificulturesifipourifi croîtreifiàifideifitrèsifihautesifidensitésificellulaires,ifigénéralementifideifi

l'ordreifideifi107 cellulesifiparifimLifiàifigrandeifiéchelleifiavecifiuneifireproductibilitéifiadéquateifi(Jayapal,ifietifial.,ifi

deifimammifères.ifiLesifibactéries,ifitelifiqueifiEscherichiaificoli, croissent beaucoup plus vite que les

cellulesifimammifères.ifiEscherichia coli aifiunifitempsifideifidoublementifideifi20ifiàifi30ifiminifi(Caro,ifi1970)ifi

résulteifi enifi uneifi productivitéifi volumétriqueifi 10ifi àifi100ifi supérieuresifi généralementifi parifi rapportifi auxifi

sensiblesifi auxifi impuretésifi duifi milieuifi etifi nécessitentifi desifi milieuxifi définisifi trèsifi complexesifietifi

2007;ifiJ.ifi Zhang,ifi 2010).ifi Ilifi estifi possibleifi deifi produireifi desifi fragmentsifi d'anticorpsifi enifi utilisantifi

Escherichia coli (Birch,ifietifial.,ifi2006;ifiJ.ifiZhang,ifi2010),ifitoutefoisifilesifianticorpsificompletsifineifisontifipasifi

tellesifiAspergillus niger etifiTrichoderma reesei sontificourammentifiemployéesifipourifiproduireifidesifi

niger. La glycosylation n'est pas la même que leur équivalentifi mammifère,ifi maisifi permetifi

théoriquementifi deifi remplirifi lesifi mêmesifi fonctions.ifi Toutefois,ifiilifi yifi aifi deifi potentielsifi problèmesifi

11ifi ifi

tabacifi(Medicagoifi Inc,ifi(Abranchesifietifi al.,ifi 2005))ifietifi laificarotteifi(Protalixifi Inc,ifi(Wolfson,ifi2013)),ifi

puisqu'ellesifi aussiifi possèdentifi laifi machinerieifi nécessaireifi pourifi effectuerifi desifi modificationsifi post-

1.1.2.2.ifiMilieuxifideificultureifi

Traditionnellement, les milieux nutritifsifiutilisésifipourifilaificultureifideificellulesifideifimammifèresifiontifi

rendentifilaifipurificationifiduifiproduitifiplusifidifficileifiabilité des

composantesifi animalesifi(Birch,ifi etifi al.,ifi 2006).ifi Cesifi milieux,ifi aussiifi appelésifi milieuxifi définis,ifi sontifi

composition des sérums, cesifimilieuxifidéfinisifiontifileifidésavantageifideifineifipasififournirifilesifimêmesifi

lignéeifi etifi chaqueifi cloneifi unifi nouveauifi milieuifi doitifi êtreifidéfiniifipourifi obtenirifi desifi performancesifi

optimales.ifi

Lesifi milieuxifi deifi cultureifi doiventifi normalementifi remplirifi lesifi fonctionsifi suivantes:ifi fournirifi lesifi

pressionifi osmotiqueifi dansifi desifi conditionsifi acceptablesifi etifi maintenirifi leifi pHifi prèsifi desifi valeursifi

12ifi ifi

croissanceifi etifi d'hormonesifi pourifi favoriserifi leurifi croissance.ifi Deifi plus,ifi laifi présenceifi deifi sels,ifi enifi

2005),ifi maisifi augmenteifi possiblementifi laifi productionifi spécifiqueifi d'anticorps,ifi n'affectantifi pasifi

ence de CO2 etifi deifi HCO3. Le CO2 estifi généralementifi

contientifi duifi NaHCO3 afinifi deifi recréerifi ceifi systèmeifi deifi tamponifi présentifi naturellementifi dansifi

CO2.ifi

1.1.3 Modes de cultureifi

Les modes de culture possibles en bioréacteur sont les mode cuvée, cuvée-alimentée,ificontinuifi

gazeuxifi étantifi alimentéifi enifi continuifi chezifi lesifi cellulesifideifimammifèreifi pourifi laifi respirationifi etifi leifi

maintienifiduifipHifiavecifileifiCO2.ifi

1.1.3.1. Modesificuvéeifietificuvéeifialimentéeifi

Le mode cuvée est le mode le plus simple de culture. Il s'agit d'inoculer un milieu de départ et par

puisqueifi lesifi limitationsifi auifi niveauifi desifi nutrimentsifi causentifi rapidementifi l'arrêtifi deifi laifi croissance,ifi

petitsifi volumesifi deifi nutrimentsifi sousifi formeifi concentréeifi afinifi d'éviterifi lesifi limitationsifi ouifilimiterifi

13ifi ifi ifi sectionifi1.1.4.ifi

1.1.3.2. Modesificontinuifietifiperfusionifi

Le mode deificultureificontinuificonsisteifienifil'approvisionnementifienificontinuifiauifibioréacteurifideifimilieuifi

enifi industrie.ifi Dansifi ceifi cas,ifi lesifi cellulesifi sontifi retenuesifi dansifi leifi bioréacteurifi parifi centrifugation,ifi

14ifi ifi ifiifi

108 cellulesifimL-1 (Clinckeifietifial.,ifi2013).ifiDeifiplus,ificontrairementifiauifimodeificuvée-alimentée,ifiilifi

effectuée, le milieu peut être directement purifié par chromatographie,ifipermettantifid'économiserifi

installationsifi nécessaireifi sontifi moinsifi imposantesifi etifi moinsifi coûteusesifi pourifi leifi modeifi perfusion,ifi

résidence moins important dans le bioréacteurifialimentéifienificontinuifi(Wurm,ifi2004).ifiLeifimodeifideifi

productionifi parifi perfusionifi estifi prometteur,ifi puisqu'ilifi permetifi deifi produireifi àifi hauteifi productivitéifi

15ifi ifi

1.1.4 Stratégies d'alimentation employéesifipourifileifimodeificuvéeifialimentéeifi

Tel que mentionné précédemment, le mode cuvéeifialimentéeifiestifileifimodeifileifiplusificourammentifi

d'alimenta ,ifiuneifi alimentationifi enifi nutrimentsifi tropifi . D'autre part, une alimentation trop faibleificauseifilaificonsommationifi

hors-ligneifi tousifi lesifi nutrimentsifi ouifi seulsifi quelques-unsifi sélectionnésifi deifi manièreifi rationnelle,ifiouifi

encoreifi alimentésifiselonifi unifiprocessusifi automatisé.ifiPuisqueifilaifistratégieifioptimaleifiàifiutiliserifipeutifi

différerifid'uneifilignéeificellulaireifiàifil'autre,ifiidéalement,ifi l'approcheifiutiliséeifi pourifidévelopperifi cetteifi

1.1.4.1. Ajouts de concentrés de milieuifi

La stratégie la plus simple consiste à alimenterifiauifibioréacteurifidesifisolutionsifideifimilieuifideificultureifi

l'ensembleifi desifi nutrimentsifi essentielsifi estifi contenuifi dansifi leifi milieuifi basal,ifi réalimenterifi ceifi milieuifi

généralementifi possibleifi deifi concentrerifi leifi milieuifi basalifi entreifi 10ifi etifi 15ifi foisifi sansifi précipitationifi

cas,ifiunificoncentréifi10xifiduifimilieuifibasalifisansifiNaCl,ifiKClifietifiNaHCO3 aifiétéifiajoutéifiàifiintervallesifi

basantifi surifilesifitauxifideificonsommationifi desifinutrimentsifi etifi surifileurifiprofilifideificonsommationifi parifi

rapportifiauifitemps.ifiifi 16ifi ifi

1.1.4.2. Identification des composants limitants et design rationnel

Afinifi d'optimiserifilaifi stratégieifi d'alimentation,ifi ilifi estifi impératififi deifi tenirifi compteifi desifi besoinsifi

Wlaschinifi etifi Huifi(2006)ifiontifiproposéifiuneifiméthodeifigénéraleifipourifidéterminerifilaificompositionifi àifi

utiliserifi pourifileifi milieuifi d'alimentation.ifi Cetteifi méthodeifi reposeifi surifi leifi calculifi desifi coefficientsifi

peuvent être obtenus à partir de données de cultures en mode cuvée. Le volume d'alimentationifiestifi

de combler les besoins nutritionnels des cellules de manière précise dans le temps. ifi

tels les vitamines et les lipides, ilifiestifiassuméifiqu'ilsifisontificonsommésificomplètementifiauifimomentifioùifi

manièreifi similaire,ifi Fanifi etifi al.ifi(2009)ifiontifi généraliséifi leifi processusifi permettantifi d'appliquerifi cetteifi

Burmanifi etifi d'unifi planifi centralifi compositeifi commeifi approcheifi statistiqueifi pourifi déterminerifi laifi

17ifi ifi

lesifi nutrimentsifi limitantsifi àifi laifi culture.ifi Laifi méthodeifi laifi plusificouranteifiestifi l'utilisationifi deifi plansifi

compositionifi desifi nucléotidesifi etifi jouantifi unifi rôleifi trèsifi importantifi auifi niveauifi deifi laifi régulationifi

concentrationifi extracellulaireifi relativementifi élevéeifi pourifi certainesifi acidesifi aminésifi tellesifi leifi

mêmeifitransporteur.ifi

1.1.4.3. Contrôle du métabolisme à l'aide du mode cuvéeifialimentée

18ifi ifi glutamine,ifiquotesdbs_dbs35.pdfusesText_40

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