CULTURE DE CELLULES ANIMALES
2.2.1 - Courbe de croissance d'une population cellulaire de la culture dans le temps. ... Temps de doublement de la population.
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CULTURE DE CELLULES ANIMALES
Courbe de croissance d'une population cellulaire de la culture dans le temps. 2.2.2. Longévité d'une culture ... "temps de doublement de la population".
Ce document est le fruit dun long travail approuvé par le jury de
populations cellulaires et 20 J..ll sur un demi-hémocytomètre pour considérés les temps de doublement des cellules sont identiques quand les cellules.
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MODÉLISATION DYNAMIQUE DE CULTURES DE CELLULES CHO
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Croissance microbienne - Suivi de croissance**
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On part de l'effectif P(t) à l'année t. Un an plus tard, la population compte P(t+1) habitants. Il ne reste plus qu'à rapporter l'accroissement P(t+1) - P(t) à l'effectif global de la population.Comment s'appelle le temps nécessaire au doublement d'une population de bactéries ?
Temps moyen dont a besoin une population (microbes, poissons, bactéries, etc) pour doubler son nombre d'individus ou de cellules. Il est généralement plus long que le temps de génération.12 sept. 2009- ?Comment fonctionne la règle ? ¶ Pour obtenir le nombre d'années nécessaires au doublement du capital, il suffit de diviser 72 par le taux de rendement annuel du placement. Pour une somme placée à x % par an, nous avons la formule : 72/x = nombre d'années requises pour le doublement.
AVERTISSEMENT
Ce document
est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale.Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr
LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
THESELabel Européen
Présentée et soutenue publiquement
le20 Juillet 1995
dans le but d'obtenir le titre deMENTION GÉNIE BIOLOGIQUE
DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
parAngelo PERAN!
Cultures d'hybridomes
Production d'anticorps ntonoclonaux-Etude de l'apoptose et applicationà la toxicité de surfactifs
Membres du jury
Président: M. le Pr. Claude SELVE Professeur à l'Université Henri Poincaré Nancy IRapporteurs :
Mme le Dr. M-Rosa INFANTE Directeur de Recherches au CISC Barcelone M. le Dr. Alan DOYLE Directeur de Recherches au CAMR Salisbury M. le Dr. Otto MERTEN Directeur de Recherches à l'Institut Pasteur ParisExaminateurs :
M. le Dr. Glyn ST ACEY Directeur de Recherches à l'ECACC Salisbury M. le Dr. Michel MAUGRAS M.C.U. à l'Université Henri Poincaré Nancy 1AVANT PROPOS
Ce travail a été réalisé principalement au sein de 1 'ex-unité INSERM (Vandoeuvre-lès-Nancy, France). Dans le cadre de la thèse à label européen, nous avons effectué une autre partie du travail expérimentalà 1 'ECACC
(European Collection of Animal Cel! Cultures) (Salisbwy, Angleterre).Je tiens, tout d'abord,
à exprimer ma profonde gratitude à M le Pr. Claude SELVE, pour avoir bien voulu être le Président de mon jwy de thèse. Je voudraiségalement
le remercier pour m'avoir permis d'approcher les problèmes concernant la chimie des tensioactifs, avec compétence et une extrême gentillesse.Agradezco muy sinceramente
à la Dra Ma Rosa INFANTE de haberse
desplazado desde Barcelona para ser miembro del jurado de tésis y de haber revisado mi manuscrito del punta de vista quimico. Lieve Ud. mi profunda gratitud.I would like
to thank Dr. Alan DOYLE to accept to review my thesis and to give me .mme interesting remarks conceming the cel! culture part of my thesis. I would also thank him, to allow me, to do my PhD project at ECACC in the best candi ti ons. Je remercie tout particulièrement le Dr. Otto MERTEN d'avoir bien vouluêtre membre
de mon jwy de thèse en tant que rapporteur. Sa compétence dans le domaine des cultures d'hybridomes et dans celui de la production d'anticmps s'est traduite sous la forme de remarques très judicieuses sur le contenu de ce manuscrit. Je vous exprime ma profonde reconnaissance.I would specially thank
Dr. Glyn STACEY for his scientific managing
during the fast nvo years. He brought me all the necessmy knowledge about molecular bio/ogy and hybridoma cel! stability. He alm participate to al! the publications and scient(fic researchs thal I have realized during this period. Glyn be sure of my andfriends·hip. 2 Je tiens à remercier tout spécialement le Dr. Michel MA UGRAS qui a été mon directeur de thèse. Une grande partie du travail que je présente dans ce manuscrit lui est due. Tout au long des cinq années passées ensemble, il a su me faire COJ?fiance et m'apporter tout son savoir-faire. Je voudrazs ici lui exprimer ma reconnaissance pour sa précieuse aide scientifique. Je tiens également à souligner ici sa générosité et ses autres qualités humaines qui font de lui quelqu'un avec qui il m'a été très agréable de travailler.J'exprime mes remerciements sincères
à Mme Mireille DONNER sans qui
ce travailn 'aurait pas pu voir le jour dans les meilleures conditions au sein de la nouvelle équipe du GRJMI. Son amabilité et sa disponibilité ont permis la réalisation matérielle et technique de cette thèse. I would also like to thank al! the ECACC team (present in early1994) : the
Dr. Alison STACEY H
1 ho help me with jinge1prints gels; Helen BEVINS for her ELISA tests, Sue for the mycoplasma tests, and al! the other members of the staff Y ou have to know that I have spend a ve1y good time with you.Je voudrais remercier également Dominique
DUMAS (mon " coéquipier "
de DEA). Une partie des résultats concernant les adaptations lui est due. Pendant de longs mois, il a partagé avec moi les longs comptages mais aussi de bons moments. Je tiens à lui souhaiter une excellente réussite professionnelle et familiale. Je remercie très sincèrement Jacky DIDELON qui, avec son excellent talent d'ingénieur, a su développer le système de tubes à dialyse. Mais je voudraiségalement
le remercier pour sa gentillesse et son amitié. Le travail concernant la cytométrie en flux n'aurait jamais pu être réalisé sans la précieuse aide de MmeSophie MARCHAL qui avec M Jean Louis
MERLIN m'ont permis
de réaliser le travail de cytométrie au Centre AlexisVautrin de Nancy.
La partie concernant l'étude des
Sllljactifs à base de noyaux jJ-lactame a été réalisée conjoilllement avec Mme Laurence MOLINA. Je tiens à lui exprimer toute mon amitié età la remercier pour sa collaboration
Je voudrais remercier, tout particulièrement, Mmes Monique GEN17L etGhislaine
GA UCHOIS, qui m 'ont fou des échantillons pendant plusieurs années. Je tiensà les remercier pour leur gentillesse et leur
disponibilité. Ce travail est le fruit d'un esprit d'équipe. Il a été enrichi par la collaboration et le travail de d?fférents étudiants en DEA au sein du laboratoire :Mlle Maria Guadalupe
SOLIS RECENDEZ qui a participé avec moi au
passionnant travail de recherche sur l 'apoptose mais également sur les antiprotéases ; M Bruno D'HABIT avec qui j'ai partagé les premiers pas de notre équipe dans la biologie moléculaire, M Francis BICHAT et Mlle Florence POIRSON qui ont travaillé dans la partie correspondant aux systèmes de tubes à dialyse et dans celle concernant les sw.facttfs ioniques ; Mlle Sophie LAMBERT pour sa collaboration dans le travail sur les sw.factifs et les myélomes et Mlle Béatrice MATHIOT qui a participé pendant mon DEA et ma première année de thèse, à la mise au point des milieux sans sérum et 1 'amélioration du système de tubes à dialyse. Je remerc_ie également pour son aide technique M Mehdi Roger BARROIS qui a réalisé zm grand nombre d'expériences de culture et de tests ELISA. Je tiens à lui exprimer mes remerciements les plus sincères. Je voudrais également remercier également 1 'équipe "Donner " : MmeSylvaine Mlle Nezha ZEGARI et Mme Sandrine
MICCOLI qui ont permis également de mener à bien ce travail. Mais ausi tous les autres membres du laboratoire. Un grand merci également à Mlle Sophie qui participe activement aux expériences qui font suite à ce travail.Je ne saurais oublier 1 'aide technique
qui m'a été apportée par MmeMichelle
PFISTER.
Enfin et surtout je remercie de tout coeur mes parents Mi/ena et MichelPERAN! qui m'ont apporté
le soutien nécessaire, matériel et moral, à tout 4 moment. Il en est de même pour mes frères et soeurs ainsi que pour les famillesMONTIGNY et HAMER.
Finalement mes plus grands remerciements reviennentà ma femme,
Fabienne, qui
m'a accompagné tout au long de ce travail de tf?èse. Elle a su me soutenir moralement, m'aider avec sa gentillesse et sa compréhension. Elle a consacré beaucoup de temps et d'amour pour que je mène ce projet à terme. Je la remercie du fond de mon coeur. 5TABLE DES MATTERES
1. ........................................................................
......................... 18 I.A. Généralités ........................................................................ ...................... 19I.B. Miliettx
et cultttres cellulaires ................................................................. 21 I.C. Hybridomes et systèmes de production d'anticorps monoclonaux ....... 24 I.D. Apoptose ou mort cellulaire programmée .............................................. 27 II. MATERIEL ET METHODES ........................................................................ .... 31 II.A. Ligr1ées cellttlaires ........................................................................ ......... 32 II.B. Milieux de culture ........................................................................ ......... 32II.B.l. RPMI
1640 ........................................................................
....... 32II.B.2.
DMEM ........................................................................ .............. 33 II.B.3. Fl2 de HAM ........................................................................ ..... 33 II.B.4. BM ........................................................................ .................... 33I.C. Systèn1es de cttltttt·e ........................................................................
........ 34II. C.l. Plaques de culture ...................................................................... 34
II.C.2. Boîtes de culture ........................................................................
34II.C.3. Spinners ........................................................................ ............ 34 II.C.4. Systèmes à membrane de dialyse ................................................ 34 II.D. Manipulation et entretien des cellules .................................................. 36
II.D.l.
Cellules semi ou peu adhérentes ................................................. 36II.D.2.
Congélation des cellules ............................................................ 36II.D.3. Décongélation des cellules ......................................................... 36
II.D.4.
Cas des tubes à dialyse .............................................................. 36 II.E. Adaptations ........................................................................ ................... 37 II.E.l. Définition ........................................................................ .......... 3 7II.E.2. Paramètres mesurés ................................................................... 37
H.F. Détermination des paramètres cellulaires ............................................. 38II.F.l.
Coloration au bleu trypan ........................................................... 38 II.F.l.a) Réactifs ....................................................................... 386 II.F.1.b) Paramètres mesurés ..................................................... 39
II.F.2. Coloration avec
le mélange bromure d'éthidium/acridine orange ........................................................................ 41II.F.2.a) Réactifs ·················· II.F.2.b) Paramètres mesurés .................................................... .42
II.G. Analyse des 1nétabolites ........................................................................
42II.G.l. Dosage des anticorps par test ELISA ....................................... .42 II. G.l.a) Principe ..................................................................... .43 II.G.l.b) Réactifs ..................................................................... .43 II.G.l.b.1) Tampons ..................................................... .43 II.G.l.b.2) Anticorps de revêtement des plaques ........... .44 II.G.l.b.3) Anticorps standard ...................................... .44 II.G.l.b.4) Anticorps marqués à la peroxydase .............. .44
II.G.l.b.5) Substrat de
la peroxydase ............................. 44II.G.l.c) Revêtement des plaques
"coating" .............................. .45 II.G.l.d) Dépôt de l'anticorps à doser. ...................................... .45 II.G.l.e) Dépôt du conjugué anticorps-peroxydase ................... .45 II.G.l.f) Paramètres mesurés .................................................... .46II.H. Analyse de l'ADN par électrophorèse .................................................. .47
II.H.l. Extraction de l'ADN ................................................................. .47 II.H.2. Dosage de l'ADN ..................................................................... .49II.H.3. Electrophorèse sur
gel d'agarose ................................................ 50 II.H.3.a) Préparation des échantillons ........................................ 50 II.H.3.b) Séparation .................................................................. 50 II.H.3.c) Visualisation ............................................................... 50 II.H.4. Empreinte digitale de l'ADN ...................................................... 51 II.H.4.a) Principe ...................................................................... 51 II.H.4.b) Marquage de la sonde oligonucléotidique 33.15 .......... 52II.H.4.b.1) Hybridation, lavage et marquage des
southern blots ................................................................ 52 7 II.H.4.b.2) Mécanisme d'action du marquage .................. 53 II.H.4.c) Deshybridation ............................................................ 53 II.H.4.d) Observation des empreintes digitales de l'ADN ............ 54 II.H.5. Electrophorèse capillaire ...........................II.I. Analyse de l'ADN par cytométrie en flux ...........................•.................. 56
II.I.l. Fixation des cellules .................................................................... 56
II.I.2. Coloration
à l'iodure de propidium .............................................. 56 II.I.3. Analyse du cycle cellulaire .......................................................... 57II.J. Analyse de la fluidité n1en1branaire ....................................................... S7
ll.K. Expérie11ces de choc thern1ique ............................................................ S8
II.L. Etttde
de surfactifs rion-ioniques ......................................................... ,59 II.L.l. Tests d'hémolyse ........................................................................ 62II.L.2. Toxicité des surfactifs sur des cultures d'hybridomes .................. 63 III. RESULTATS: ........................................................................ ... 65
III.A. Adaptations des cellules
à un nouveau milieu de culture ................... 66 III.A.l. Adaptations lentes .................................................................... 67 III.A.l.a) Adaptations tenant compte de la viabilité ................... 68 III.A.l.b) Adaptations tenant compte de la viabilité et du temps de génération .................................................................. 69 III.A.2. Adaptations rapides .................................................................. 71III.A.2.a) Changement de milieu de base ................................... 72
III.A.2.b)
Passage d'un milieu supplémenté en SVF à un milieu sans sérum en conservant le même milieu de base ............ 73III.A.2.c) Passage d'un milieu sans sérum à un milieu supplémenté avec des additifs .................................................... 75 III.A.3. Evolution de la croissance cellulaire et production d'anticorps au cours de changements de milieu ...................................... 76 III.A.4. Discussion ........................................................................ ........ 79
III.B. Systèn1es de Ctlltttre 83
III.B.l. Culture en boîtes ...................................................................... 83
8 III.B.l.a) Concentrations cellulaires ........................................... 83 III.B.l.b) Viabilités ................................................................... 84III.B.2. Culture en flacons
à agitation ................................................... 85 III.B.2.a) Concentrations cellulaires .......... : ................................ 85 III.B.2.b) Viabilités ................................................................... 86III.B.3. Culture en tubes
à dialyse ......................................................... 87 III.B.3.a) Concentrations cellulaires ........................................... 88 III.B.3.b) Viabilités ................................................................... 89 III.B.4. Empreinte digitale de l'ADN ..................................................... 90III.B.5. Analyse de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose ............. 91 III.B.5.a) Culture en boîtes ........................................................ 91 III. B. 5. b) Culture en flacons à agitation ..................................... 92 III.B.5.c) Culture en tubes à dialyse ........................................... 93
III.B.6. Discussion ........................................................................ ........ 94
III.B.
7. Etude complémentaire de systèmes de culture à base de
tubes à dialyse ........................................................................ .............. 99 III. B. 7.a) Présentation du système ............................................. 99 III.B.7.b) Culture d'hybridomes 12H8 et A49 ............................ 100III.B. 7.b.l) Culture avec des milieux sans sérum ............ 1 00 III. B. 7.b.2) Utilisation d'antiprotéases ............................ ! 03 III.B. 7.c) Evolution du système de culture à dialyse ................... l 05 III.B. 7.d) Utilisation du système de culture, son évolution ......... 1 07 III. B. 7.e) Différentes lignées cultivées ....................................... 109 IV. J\.'IORT CELLULATRE ........................................................................ ............... ll3
IV.A. Tech11iqties de détectior1 ...................................................................... 113
IV.B. A
po ptose indtiite ........................................................................ .......... 113 IV.B.l. Choc thermique ........................................................................ 114IV.B.l.a) AFRC MAC 65 ......................................................... 114 IV.B.l.b) HF2 x 653 ................................................................. 115 IV.B.1.c)OX 19 ....................................................................... 116
9 IV.B.2. Privation de sérum -Adaptation à un milieu sans sérum ............ 117 IV.B.3. Induction par des molécules de faible poids moléculaire ............ 124 IV .C. A JlOJltose ........................................................................ ..... 126 IV.C.1. Hybridome A49 ...................................... ; ................................ 126 IV.C.2. Hybridome 12H8 ..................................................................... 129
IV.C.3. Généralisation du phénomène ................................................... l30
Caractérisation d'une lignée d'hybridomes résistante à I'apoptose ........................................................................ ............................... 131 IV.D.l. avec les cellules A49 ........................................... 131 IV.D.2. Myélon1es ........................................................................ ........ 136IV.D.3.
Conclusions ........................................................................ ..... 138 V. CELLULAIRE ET SURF ACTIFS ......................................................... 140 VI. GENERALE ........................................................................ ....... 149 VI.A. Production d'anticorps monoclonaux ................................................. 150 VI.B. Mort des hybridomes par apoptose ..................................................... 153 VI.C. Surfactifs non ioniques et toxicologie .................................................. 159 VIT. CONCLUSJON ........................................................................ .......................... 163 VIII. BIBLIOGRAPHTE ........................................................................ ................... 168 IX. ANNEXE ........................................................................ ..................................... 186 10 INDEXFigures:
1.1 : Eléments essentiels à la croissance cellulaire, 21
1.2 : Eléments constitutifs d'un milieu de culture, 22
1.3 : Différentes étapes de l'hybridation cellulaire, 25
1.4 : Différents types de mort cellulaire, 29
2.1 : Schéma de principe du système de culture à dialyse, 35
2.2 : Molécule de bleu trypan, 38
2.3 :Formules du bromure d'éthidium et de l'acridine orange, 41
2.4 : Cellules colorées avec le mélange bromure d'éthidium, 42
2.5 : Schéma de principe du test ELISA, 43
2.6 : Schéma d'extraction et de dosage de l'ADN cellulaire, 48
2. 7: Spectre du couple ADN/HOECHST 33258, 49
2.8 :Empreinte digitale de l'ADN, 51
2.9: Méthode NICETM de marquage des sondes oligonucléotides, 52
2.10 : Calibration du tube de l'électrophorèse capillaire, 55
2.11 : Molécule de TMA-DPH, 57
2.12 : Surfactifs à base de noyau bêta-lactame, 61
2.13 : Protocole d'incubation des surfactifs, 64
3.1 : Adaptation par étapes avec trois souches d'hybridomes, 68
3.2: Adaptations par une méthode dérivant de celle décrite par, 70
3.3 : Adaptations suivant la méthode décrite par Chandler, 71
3.4: Adaptations à un nouveau milieu de base, 72
3.5 :Adaptations de trois souches d'hybridomes, 74
3.6 :Adaptations vers milieu BM-IBF, 75
3. 7 : Intégrales de cellules vivantes après adaptation, 7 6
3.8 :Production d'IgM avant et après adaptation, 77
3. 9 : Productivité en anticorps avant et après adaptation, 77
3.10 : Evolution de la concentration en cellules vivantes, 83
3.11 :Evolution de la concentration en cellules totales, 84
113.12 : Evolution des pourcentages de viabilité, 84
3. 13 : Evolution de la concentration en cellules vivantes, 85
3.14 : Evolution de la concentration en cellules totales, 86
3.15 : Evolution des pourcentages de viabilité, 86
3.16 : Evolution de la concentration en cellules vivantes,
883.17 : Evolution de la concentration en cellules totales, 88
3 .18 : Evolution des pourcentages de viabilité, 89
3.19 : Empreinte digitale de l'ADN, 90
3.20: Electrophorèse sur gel d'agarose, 91
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