[PDF] [PDF] Kit drépanocytose Réf DREPAN - SORDALAB

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com A RECEPTION DU COLIS : ! Vérifier la composition du colis indiquée ci-dessous ! Stocker les articles du colis dans les bonnes conditions : - !Placer le sachet noté O à - 20°C! - !Placer le flacon de rouge ponceau et les bandes d'acétate de cellulose température ambiante - Laisser le flacon de t ampon tris Glycine et le tube contenant les micros capillaires à température ambiante Attention : Ces conditions de stockage sont à respecter scrupuleusement pour permettre une conservation générale des produits du kit de 6 mois. ! Avant toute manipulation, étudier la fiche sécurité COMPOSITION (pour 20 binômes) : - 1 tube de micro-capillaires de dépôt - 1 flacon noté " tampon tris Glycine » pour la préparation de 1 L de tampon de migration - 1 sachet de 25 bandes d'acétate de cellulose 25x140 mm - 1 sachet noté O de 2 microtubes à stocker à - 20 °C contenant : o 1 microtube à bouchon de couleur rouge de 300µL de solution d'hémoglobine A o 1 microtube à bouchon de couleur mauve de 300µL de solution d'hémoglobine S - 1 flacon de 500 ml de rouge ponceau prêt à l'emploi MATERIEL NECESSAIRE : - Pipettes de 10 mL - Poire à pipeter ou pipump - Eprouvette de 500 ml - Flacon d'1L - Flacon de 500 ml - Feutres permanents - Micropipette 0,2 ml ou poire à goutte calibrée - Gants - Lunettes de protection - Papier aluminium - Pince fine - Microtube à bouchon - Récipient pour bains de coloration et de décoloration - Cuve à électrophorèse avec support de bandes, alimentation continue de 125 V et 250 mA - Acide acétique glacial pour faire de l'acide acétique 5% MATERIEL CONSEILLE : - Portoir à microtubes - Pour solution de transparisation : méthanol, acide acétique, diacétone alcool. - Flacon de 100 ml OBJECTIFS COGNITIFS L'utilisation du kit repose sur la situation de prédiction médicale recréée artificiellement compte tenu de l'interdiction d'utiliser des prélèvements d'origine humaine en travaux pratiques. On considère une famille fictive dans laquelle l'hémoglobine drépanocytaire est présente et pour laquelle on souhaite établir les génotypes des individus et l'arbre généalogique de façon à évaluer la probabilité que la maladie se manifeste chez un enfant à naître. Les hémoglobines des parents et de leurs enfants sont reconstituées à partir des solutions fournies. Ces dernières sont préparées chez Sordalab à partir de cristaux d'hémoglobine qui garantissent l'absence de tout germe pathogène dans les solutions. L'hémoglobine des individus hétérozygotes est reconstituée en mélangeant un volume de chacune des deux solutions A et S tandis que l'hémoglobine des individus homozygotes correspond à chacune des deux solutions A et S fournies qui sont utilisées directement. Le kit fournit également le reste du matériel consommable nécessaire pour réaliser l'électrophorèse.

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com RAPPELS Introduction générale sur la drépanocytose, les hémoglobines et l'électrophorèse : La drépanocytose ou anémie falciforme est l'hémoglobinopathie héréditaire la plus répandue dans le monde : elle affecte plusieurs centaines de milliers de personnes dont plus de 5 000 en France. Dans cette maladie, lorsque la pression partielle en oxygène est faible, comme dans les capillaires périphériques, l'hémoglobine des sujets atteints a tendance à polymériser en longues fibres rigides qui déforment les globules rouges en leur conférant une f orme de faucille qui les e mpêche de pas ser dans les capillaires les plus fins, fr einant ou bloquant leur circulation. L'hémoglobine anormale, S (sickle), ne diffère de l'hémoglobine normale, A, que par un seul acide aminé de la chaîne bêta en position 6 (acide glutamique remplacé par valine). Les deux allèles ne diffèrent que par un codon. On peut distinguer les deux hémoglobines par leur mobilité électrophorétique. La caractérisation et la comparaison de diverses protéines peut être ai sément réalisée par électr ophorèse sur bande d'acétate de cellulose ou s ur gel d'agarose. En appliquant la techni que à l'hémoglobine extraite des globules rouges d'un individu, on peut donc déterminer quelle(s) hémoglobine(s) il possède et en déduire son génotype : hétérozygote, HbA/HbS ou homozygote HbA/HbA ou HbS/HbS. Ainsi, il est possible d'étudier les relations génotype-phénotype mais aussi de construire un arbre généalogique et de faire des prévisions en génétique humaine. En outre, l'identification des génotypes dans diverses populations permet d'établir la fréquence des allèles et de relier génétique et évolution. Kit en première S : Insertion du kit dans le programme : Dans la parti e du prog ramme " du génoty pe au phénotype, rel ations avec l'environnement », l'ét ude de la drépanocytose est recommandée pour illustrer la diversité des phénotypes et la complexité des relations entre gènes, phénotypes et environnement : Extrait du programme : • Diversité des phénotypes : analyse d'un exemple comme la drépanocytose ; comparaison de la structure des protéines en relation avec l'exemple étudié. • Complexité des relations entre gènes, phénotypes et environnement : cas des drépanocytoses. Objectif cognitif : Caractérisation de phénotypes moléculaires et identification des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine Les allèles de la chaîne bêta des hémoglobines A et S diffèrent par une mutation ponctuelle (substitution) qui modifie un seul codon. Cette mutation aboutit au remplacement de l'acide glutamique en position 6 par la valine. Il en résulte que les hémoglobines A et S diffèrent par leur charge électrique car la valine possède une charge négative de moins que l'acide glutamique au pH alcalin (pH 8,6) où l'on réalise l'électrophorèse. C'est pourquoi l'hémoglobine A migre plus loin que l'hémoglobine S lors de l'électrophorèse. Kit en terminale S : Insertion du kit dans le programme : Dans la partie du programme " stabilité et variabilité des génomes et évolution », il est noté qu'il faut traiter de l'apport de l'étude des génomes et des innovations génétiques. La drépanocytose est un exemple adapté de relation entre mécanismes de l'évolution et génétique. Extrait du programme : Stabilité et variabilité des génomes et évolution • L'apport de l'étude des génomes, les innovations génétiques • Étude d'exemples de relation entre mécanismes de l'évolution et génétique Objectif cognitif : le polymorphisme génétique Le polymorphisme génétique résulte de l'accumulation de mutations. Les mutations qui confèrent un avantage sélectif aux individus qui en sont porteurs ont une probabilité plus grande de se répandre dans la population. La démarche est de même nature qu'en première S puisqu'il s'agit d'identifier phénotypes et génotypes liés aux allèles de la chaîne bêta de l'hémoglobine mais l'objectif est différent puisqu'il s'agit en terminale de relier la génétique à l'évolution. Sur le terrain, l'ident ification de s hém oglobines a permis d'établir la fréquence des allèles dans les populations et de constater ainsi que l'allèle S, pourtant défavorable, s'est maintenu à une fréquence élevée dans les zones de paludisme endémique où il constitue une protection à l'état hétérozygote. Exercice proposé pour 20 binômes (40 élèves) : Les binômes disposent de tubes contenant l'hémoglobine A et l'hémoglobine S. Ils ont aussi des tubes numérotés correspondant aux hémoglobines d'une famille dont l'arbre généalogique est le suivant :

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com Un exercice supplémentaire consiste à trouver les génotypes possibles pour l'enfant 7 en s'appuyant sur les génotypes des parents. PREPARATION PREPARATION DU TAMPON DE MIGRATION (Étape réalisable à l'avance et conservation de la solution à l'abri de la lumière à 4°C pendant 1 mois) Ajouter au flacon noté TRIS GLYCINE 900 ml d'eau déminéralisée. Conserver à température ambiante ou + 4°C pendant 1 mois. REALISATION DES SOLUTIONS D'HEMOGLOBINE A DEPOSER Pour plus de clarté, vous pouvez noter A le microtube à bouchon rouge du sachet C stocké au congélateur et noter S le microtube à bouchon mauve. • Prélever 105 l à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon rouge du sachet C stocké au congélateur. • Verser dans un microtube vide et propre • Noter ce tube " A/S » • Prélever 105 l à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon mauve Verser dans le microtube noté " A/S » • Agiter ce microtube • Conservation des microtubes à - 20°C pendant 6 mois PREPARATION DES MICROTUBES POUR LES ELEVES • Prélever 45 µL dans le microtube " A » et les transvaser dans un microtube à noter " 4 ». Ce tube va servir pour 3 dépôts. • Prélever 45 µL dans le microtube " S » et les transvaser dans un microtube à noter " 5 ». Ce tube va servir pour 3 dépôts. • Prélever 60 µL dans le microtube " A/S » et les transvaser dans un microtube à noter " 1 ». Ce tube va servir pour 4 dépôts. • Prélever 60 µL dans le microtube " A/S » et les transvaser dans un microtube à noter " 2 ». Ce tube va servir pour 4 dépôts. • Prélever 45 µL dans le microtube " A/S » et les transvaser dans un microtube à noter " 3 ». Ce tube va servir pour 3 dépôts. • Prélever 45 µL dans le microtube " A/S » et les transvaser dans un microtube à noter " 6 ». Ce tube va servir pour 3 dépôts. Ce qui reste dans le tube " A » servira pour 10 dépôts et ce qui reste dans le tube " S » servira pour 10 dépôts. Ces tubes se conservent à - 20 °C pendant 6 mois PREPARATION DES BANDES D'ELECTROPHORESE Mettre des gants et des lunettes • Faire tremper l es bandes d'acétate de cel lulose pendant 10 minutes dans le tampon de migration. • Déposer les bandes sur un papier filtre afin d'éliminer l'excès de tampon. • Placer 2 bandes sur l e support de la cuve d'électrophorèse.

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com • Pour savoir sur quelle face de la bande déposer les protéines, il faut se repérer à l'aide de l'encoche (qui sera placée du côté cathode (électrode noire) de la cuve) : PREPARATION DE LA SALLE • Installer les bandes dans les cuves • Disposer les tubes " A », " S », " 1 », " 2 », " 3 », " 4 », " 5 » et " 6 » de manière à ce que chaque binôme puisse avoir accès aux tubes pour faire leur dépôt. • Associer un capillaire à un microtube (le tremper dedans par exemple) APRES LE TRAVAIL DES ELEVES • Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 60 minutes à 125 V ; ne pas dépasser 160V). • Mettre des gants et des lunettes pour réaliser toutes les étapes suivantes • Après migration, placer les bandes dans le colorant issu de la bouteille notée " rouge ponceau » pendant 10 minutes. • Décolorer les bandes dans trois bains successifs de 3 minutes d'acide acétique à 5 %. • Préparer éventuellement (non obligatoire) une solution de transparisation (qui permet de faciliter la lecture des résultats) : 75ml de Méthanol + 20ml d'Acide acétique + 5ml de Diacétone alcool dans un flacon de 100 ml "" ATTENTION "" : le méthanol est très inflammable et toxique. Il faut manipuler avec des gants, des lunettes, une blouse et sous une hotte ou à défaut, dans un endroit ventilé. - Tremper les bandes dans cette solution jusqu'à ce qu'elles deviennent translucides. Après la révélation, les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire. MANIPULATION : REALISATION DES DEPOTS : "" ATTENTION "" : Veiller à prélever chaque échantillon d'hémoglobine avec un capillaire différent et à ne pas mélanger les capillaires. - Faire des groupes de 2 binômes : 2 binômes (A et B) déposent sur la même bande - Poser la bande sur son support dans la cuve à électrophorèse de protéines en orientant le support de manière à ce que l'encoche et la ligne de dépôt soit du côté de la cathode (électrode noire) COTE CATHODE (noir) COTE ANODE (rouge) Pour le binôme A : - Dépôt en position 1 : o Tremper le capillaire de dépôt dans le microtube noté " A » o Appliquer le capillaire sur la bande d'acétate déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité du côté de la cathode (borne noire) de manière à faire une goutte de dépôt o Remettre le capillaire dans le microtube noté " A » - Dépôt en position 2 : o Choisir un tube numéroté et réaliser le second dépôt de la même façon que le dépôt du tube " A » mais avec le capillaire du tube numéroté. Pour le binôme B : - Dépôt en position 3 : o Tremper le capillaire de dépôt dans le microtube noté " S » o Appliquer le capillaire sur la bande d'acétate déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité du côté de la cathode (borne noire) de manière à faire une goutte de dépôt o Remettre le capillaire dans le microtube noté " S » - Dépôt en position 4 : o Choisir un tube numéroté (différent du tube choisi par le binôme A) et réaliser le second dépôt de la même façon que le dépôt du tube " S » mais avec le capillaire du tube numéroté. #NB# : il faut que chacun des tubes numérotés soient déposé sur bande d'acétate pour que le génotype soit connu après électrophorèse.

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com Exemple de répartition : Bande d'acétate Binômes Dépôt 1 Dépôt 2 Dépôt 3 Dépôt 4 1 A tube A tube 1 -- -- 2 B -- -- tube S tube 6 3 A tube A tube 2 -- -- 4 B -- -- tube S tube 1 5 A tube A tube 3 -- -- 6 B -- -- tube S tube 2 7 A tube A tube 4 -- -- 8 B -- -- tube S tube 3 9 A tube A tube 5 -- -- 10 B -- -- tube S tube 4 11 A tube A tube 1 -- -- 12 B -- -- tube S tube 6 13 A tube A tube 2 -- -- 14 B -- -- tube S tube 5 15 A tube A tube 3 -- -- 16 B -- -- tube S tube 6 17 A tube A tube 4 -- -- 18 B -- -- tube S tube 1 19 A tube A tube 5 -- -- 20 B -- -- tube S tube 2 Si vous êtes 20 s, suivez ce tableau. Si vous êtes seulement 10 s, suivez les lignes des bandes d'acétate de 1 à 10. LANCEMENT DE L'ELECTROPHORESE : - Remplir la cuve avec le tampon de migration de manière à recouvrir les électrodes. - Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 60 minutes à 125V). COLORATION DES BANDES : - Mettre des gants et des lunettes - Après migration, placer les bandes dans le colorant issu de la bouteille notée " rouge ponceau » pendant 10 minutes. - Décolorer les bandes dans trois bains successifs de 3 minutes d'acide acétique à 5 %. TRANSPARISATION (Réalisable pour conserver les bandes plus longtemps et améliorer l'observation) "" ATTENTION "": le méthanol de la solution de transparisation est très inflammable et toxique. Il faut manipuler avec des gants, des lunettes, une blouse et sous une hotte ou à défaut, dans un endroit ventilé. - Tremper les bandes dans une solution de transparisation jusqu'à ce qu'elles deviennent translucides. - Les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire EXERCICE PROPOSE : En comparant avec la migration des hém oglobines A et S, vous pouvez ident ifier les hémoglobines des membres d'une famille dont l'arbre généalogique est le suivant :

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com Un exercice supplémentaire consiste à trouver les génotypes possibles pour l'enfant 7 en s'appuyant sur les génotypes des parents. RESULTATS ATTENDUS ET INTERPRETATION Les deux hémoglobines A et S ne diffèrent que par un acide aminé de la chaîne β (constituée de 146 AA). C'est pourquoi la différence de migration est si faible. Le radical R des deux acides aminés est : HbA: GLU: CH2-CH2-COOH HbS: VAL: CH-CH3 CH3 Les protéi nes migrent en fonction de leu r masse molaire, de leur s charges électriques et de leurs formes. L'hémoglobine A est plus rapide. Pourta nt ell e possède u ne masse molaire plus importante. Ce n'est donc pas le critère dominant. L'hémoglobine A porte une fonction COOH supplémentaire : -COOH " -COO- + H+ Elle migre plus vite car la migration se fait vers l'anode. #NB#: la différence de migration est très faible. Avec les dépôts réalisés, les élèves peuvent reconstituer l'arbre suivant et prédire les génotypes possibles pour l'enfant 7 : FICHE SECURITE (guide non exhaustif) L'acide acétique est un produit dangereux qui nécessite le port de gants, de lunettes et d'une blouse. Le tampon tris Glycine et les hémoglobines ne requièrent pas de précautions d'utilisation particulières. Nous vous recommandons tout de même de manipuler ces avec des gants pour éviter tout danger. Le colorant rouge de ponceau se manipule avec blouse, gants et lunettes. La solution de transparisation est toxique fait de la présence de méthanol et de diacide acétone dans la composition. Produit Pictogramme et risques normalisés Actions à mener en cas de contact avec la peau d'inhalation de projection dans les yeux d'ingestion

Kit drépanocytose Réf. DREPAN SORDALAB | PARC SUDESSOR - 15 Avenue des Grenots - 91150 ETAMPES - FRANCE Tél. : +33 1 69 92 26 72 - Fax : +33 1 69 92 26 74 - www.sordalab.com - Mail : info@sordalab.com Rouge Ponceau Nocif Laver immédiatement la peau avec une grande quantité d'eau claire pendant au moins 15 minutes. Laver les vêtements contaminés avant de les utiliser. Emmener la personne à l'air frais. Si elle ne respire pas, la mettre sous respirateur artificiel. Si la personne respire avec difficulté, lui administrer de l'oxygène et appeler un médecin. Rincer immédiatement les yeux à grande eau pendant au moins 15 minutes en séparant les paupières. Si la personne est consciente, lui rincer immédiatement la bouche avec de l'eau. Appeler un médecin. FICHE CONSERVATION Le flacon noté " tampon tris Glycine » doit être stocké à température ambiante et est conservable jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette 1 sachet de 25 bandes d'acétate de cellulose 25x140 mm à température ambiante, voir la date indiquée sur le sachet Le tampon tris Glycine en solution se conserve à température ambiante ou 4°C pendant un mois. La solution de rouge ponceau se conserve 6 mois à + 4°C à l'abri de la lumière. Les bandes d'acétate, une fois le paquet ouvert, se conservent 1 mois à + 4°C Après transparisation, les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire, à température ambiante. (La solution de transparisation se conserve 1 an à température ambiante) 1 sachet noté O de 2 microtubes à stocker de - 20 °C contenant : o 1 microtube à bouchon rouge de 300µL de solution d'hémoglobine A est conservable 6 mois o 1 microtube à bouchon violet de 300µL de solution d'hémoglobine S est conservable 6 mois La solution d'hémoglobine S et A se conservent pendant 6 mois à - 20 °C La solution de transparisation est conservable à température ambiante pendant plusieurs mois. "" ATTENTION "" : les températures de conservation doivent être respectées pour que les rées de conservation soient applicables. FICHE TRI ET RECUPERATION Les hémoglobines et le tampon tris Glycine peuvent être jetés à l'évier. Le rouge Ponceau peut être jeté à l'évier mais surtout pas dans un container contenant des bases fortes ou des acides forts. L'acide acétique doit être jeté dans les containers à acide. Les bandes sont jetables à la poubelle. La solu tion de transparisation es t dangere use et doit absolument être jetée dans les bido ns de récupé ration des solvants organiques. Les tubes en plastique non contaminés avec des produits dangereux peuvent être jetés dans les bacs de récupération plastique.