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UNIVERSITE D'EVRY VAL D'ESSONNE

Ecole doctorale " Des génomes aux organismes » THESE

Présentée pour l'obtention du titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE D'EVRY VAL D'ESSONNE

Mention " Biologie Cellulaire et Moléculaire » par

Xavier NISSAN

Etude des mécanismes moléculaires et cellulaires de l'engagement épidermique des cellules souches pluripotentes humaines Soutenue le 03 Mai 2010 à 14h à Evry, devant le jury composé de

Pr Jeanine Tortajada Président du jury

Dr Michèle Martin Rapporteur

Dr Lionel Larue Rapporteur

Dr Ludovic Vallier Examinateur

Dr Christine Baldeschi Co-Directeur de thèse

Dr Marc Peschanski Co-Directeur de thèse

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Remerciements :

Je tiens à remercier chaque membre du jury d'avoir accepté de juger ce travail de thèse : -Le Pr Jeanine Tortajada d'avoir accepté d'être la présidente de ce jury. -Les Dr Michèle Martin Lionel Larue d'avoir accepté d'être les rapporteurs de ce travail et le Dr Ludovic Vallier d'avoir accepté d'en être l'examinateur. -Les Dr Marc Peschanski et Christine Baldeschi d'avoir été mes co-directeurs de thèse.

Je remercie :

Marc Peschanski pour m'avoir accueilli et donné sa confiance dès mon arrivée dans

l'équipe, pour ses conseils tout au long de ma thèse et pour la grande liberté qu'il a su me

laisser. Gilles Waksman qui a su croire en moi au moment le plus important de ma carrière et

qui m'a donné la chance de travailler sur un sujet aussi passionnant. Je sais qu'il aurait été fier

du travail que l'on a accompli en son nom. Christine Baldeschi, pour avoir encadré mon travail de recherche durant cette thèse, je

te remercie pour ton aide et tes conseils qui se sont avérés être précieux du début à la fin de ce

projet. Je garderai un très bon souvenir autant personnel que professionnel de ces trois dernières années. Cécile et Walter....Qu'est ce que je pourrai dire d'autre que MERCI!!!!!!!!!! Ca fait maintenant presque 5 ans que je vous connais et que je partage avec vous les bons comme les mauvais moments...Merci à tous les deux pour votre soutien inconditionnel et vos encouragements. Vous avez toujours cru en moi malgré ce que certains pouvaient en dire. J'ai toujours pu compter sur votre amitié et j'espère la garder encore longtemps... Alexandra, Sandrine mes chercheuses préférées ! J'ai eu la chance de travailler avec

vous deux et en garderai un très bon souvenir. Merci à toutes les deux pour votre écoute et

vos conseils avisés. Manoubia...Ah Manoubia !!! Ca a été un réel plaisir de travailler à tes cotés, tes compétences n'ont d'égales que ta bonne humeur. Je te remercie pour les mille et un services que tu m'as rendus, pour les heures passées au cryostat...et je te promets de couper moi même les prochains épidermes...promis... Gilles, qui a toujours su trouver les bons mots pour conclure nos discussions

scientifiques enflammées...J'espère juste pouvoir un jour arriver à être aussi " sage » que

toi...Merci pour tes conseils et ton aide dans la rédaction de ce manuscrit. 3 Lionel, Jessica et Benoite qui forme une véritable petite " Dream Team »...je suis très heureux d'avoir eu le privilège de travailler avec vous Jacky, Delphine et Jérôme, merci à tous les trois pour votre bonne humeur permanente. C'est vraiment agréable de travailler avec des gens aussi gentils et souriants que vous... Michel, Anselme et Marc L, qui m'ont tant appris sur les relations humaines. Merci à tous les trois de m'avoir permis d'illustrer l'aphorisme de Nietzsche " Ce qui ne te tue pas, te rend plus fort ». Grace à vous je suis beaucoup plus fort. Un grand merci également à toutes les personnes avec qui j'ai eu le plaisir de collaborer durant ces trois dernières années, Yacine Mathilde, Geneviève, TingTing... Mes voisins du " bureau des thésards » avec qui j'ai partagé quelques délires de

laboratoire très sympathiques. J'ai une pensée particulière à Antoine qui a parfaitement joué

son rôle de secrétaire...Encore désolé pour ça Antonio !!!! Je pense également à Karine, ma

chère " collègue », à Maxou, Sophie, Aurore, Morgane, Jéjé ou encore Delphine qui m'ont

supporté ces deux dernieres années !! Je tiens également à remercier pas mes parents pour tout ce qu'ils ont toujours fait

pour moi, pour les valeurs qu'ils ont su m'inculquer et pour ces années passées à tout sacrifier

pour leurs enfants... Je sais à quel point vous êtes fier d'avoir un enfant " Dr » ... Laissez

moi vous dire à quel point je suis fier de vous avoir comme parent... Je n'ai qu'une chose à vous dire...Merci, Merci et encore Merci. Je termine ces remerciements par les personnes qui me sont les plus chères et dont les sourires me comblent de bonheur chaque jour, mon fils, David et ma femme, Celine...Je vous aime plus que tout 4

Résumé

Les cellules souches pluripotentes d'origines embryonnaires (cellules hES) ou induites

à la pluripotence (cellules iPS) possèdent deux propriétés essentielles, l'autorenouvellement et

la pluripotence. Ces deux propriétés font de ces cellules une ressource biologique unique pour l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement embryonnaire précoce. L'objectif de mes travaux a, dans un premier temps, été de mettre en place des modèles expérimentaux permettant l'engagement des cellules hES et iPS dans les deux principaux

types cellulaires de l'épiderme : Les kératinocytes et les mélanocytes. J'ai ainsi participé à

l'élaboration d'un protocole permettant d'orienter la différenciation des cellules hES vers un phénotype épithélial. Ce protocole démontre que les cellules souches pluripotentes se différencient in vitro selon un programme génétique similaire à celui qui régit le développement embryonnaire in vivo. En effet nous montrons dans cette étude, qu'au cours du processus de différenciation, les cellules souches pluripotentes acquièrent dans un premier

temps un phénotype épithélial simple, avant de s'engager dans le lignage kératinocytaire et

exprimer les marqueurs caractéristiques des kératinocytes basaux de l'épiderme. Par ailleurs

nous montrons également que placées dans les conditions permettant leur différenciation

terminale, ces cellules sont capables de générer un épiderme pluristratifié normal à la fois in

vitro et in vivo. La deuxième partie de ma thèse a donc consisté à différencier ces cellules

souches pluripotentes en une population pure et homogène de mélanocytes. Ces travaux actuellement en cours de publication démontrent qu'une fois différenciées, ces cellules présentent une morphologie dendritique similaire à celle de mélanocytes adultes, qu'elles expriment l'ensemble des marqueurs de la mélanogénèse et qu'elles sont capables de transférer leurs mélanosomes à des kératinocytes en coculture. Sur la base de ces résultats, la dernière partie de ma thèse a eu pour but de comprendre

le rôle d'une nouvelle classe de régulateurs développementaux récemment mis en évidence :

Les microARNs. J'ai ainsi entrepris une analyse comparative des profils de microARNs au cours de l'engagement épithélial de cellules hES et mis en évidence un set de quatre microARNs (miR-200a, miR-203, miR-205 et miR-429) spécifiquement surexprimé au fur et à mesure de ce processus de différenciation. L'analyse fonctionnelle réalisée sur des

progéniteurs épithéliaux en cours de différenciation a par la suite démontré que seul miR-203

pouvait contrôler ce processus. Enfin j'ai participé à la mise en évidence du rôle des

microARNs dans le contrôle de la spécification neurale des cellules hES sur la base d'un protocole combinant l'inhibition de la voie des BMPs avec celle de la voie Activine/Nodal. A 5 l'issue de ce projet, nous avons démontré que la prise de décision dans l'engagement neural des cellules hES était comprise entre 2 et 5 jours et qu'un microARN, miR-125a, était directement impliqué dans le contrôle de ce processus L'ensemble de ces données démontre que les cellules souches pluripotentes représentent un

modèle pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le

contrôle du développement embryonnaire humain. Nous avons ainsi démontré que la différenciation des cellules souches pluripotentes dans le lignage épidermique respectait la chronobiologie du développement et mis en évidence le rôle régulateur de deux microARNs dont les fonctions n'avaient pas été identifiées, à ce jour, dans le développe ment embryonnaire humain.

Mots clés :

Cellules souches embryonnaires humaines, cellules souches induites à la pluripotence, Différenciation, Keratinocytes, Mélanocytes, microARNs 6

Abstract

Human embryonic stem cells (hESC) and induced pluripotent stem cells (iPSC) are characterized by their two fundamental properties: pluripotency and self-renewal. Due to these unique capacities, pluripotent stem cells offer a virtually unlimited biological resource capable to differentiate into any cell type of the organism. In parallel to their great potential for regenerative medicine, these cells represent a unique in vitro model of early human development. The aim of this thesis is to investigate the molecular and cellular events occurred during epidermis formation in the Human. The first objective of this work was to set up protocols to differentiate pluripotent stem cells, (hES and iPS) into the two major cell types of epidermis: Keratinocytes and Melanocytes. Thus I have participated to the development and the characterization of a protocol leading to the derivation of a pure, homogeneous and functional population of keratinocytes. We demonstrated in this study that pluripotent stem cells engaged in the epithelial lineage respected a genetic program similar to embryonic development with first the acquisition of a simple epithelium phenotype before to express markers of basal layer keratinocytes. We then reported that these pluripotent stem cells derived keratinocytes were able to generate a functional pluristratified epidermis as well as in vitro and in vivo. The second part of this thesis was to define the conditions to derivate melanocytes from pluripotent stem cells. This work, currently under publication, demonstrated that pigmented progenitors cells can be obtain either from hES or iPS can be secondarily differentiate into a pure population of cells presenting all the characteristics of melanocytes in term of morphology, expression profile and capacity to produce and secrete melanosomes. In parallel to this work the last part of my thesis was to study the role of a new call of developmental regulator: MicroRNAs. Thus, I performed High Throughput microRNAs profiling experiments and identified a set of four microRNAs involved in the epithelial commitment of hES cells (miR-200a, miR-203, miR-205 et miR-429). Functional gain and loss of function analysis were performed and confirmed the crucial role of miR-203 during human embryonic epidermis development. Finally, I participate to the identification of miR-

125a in early neural development induced by the dual inhibition of BMPs and Activin/Nodal

pathways. Taken together, all these data demonstrate that human pluripotent stem cells represent a unique model to study molecular and cellular mechanisms involved in early embryonic development in the Human. By defining experimental procedure to differentiate these cells into pure populations of keratinocytes, melanocytes and neural progenitors we have been able to demonstrate that pluripotent stem cells follow the entire chronobiology of embryonic 7 development and highlighted the regulatory functions of two microRNAs previously described in the mouse but never identified in the Human.

Key words: Embryonic stem cells, Induced

pluripotent stem cells, Differentiation,

Keratinocytes, Melanocytes, MicroRNAs

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Liste des abréviations

ACE : Antigène carcino embryonnaire

ACTH : Adrenocorticotropic hormone

Adh+++ : Cellules à forte capacité d'adhérence

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADULT: Acro-dermato-ungual-lacrymal-tooth

AEC: Ankyloblepharon-ectodermal dysplasia-clefting

AEM: Antigène epithélial membranaire

Ago: Argonaute

AMP: Assistance médicale à la procréation

AMPc: Cyclic adenosine mono- phosphate

AP-1: Activator protein-1

ARNm: Acide ribonucléique messager

ASP: Agouti signaling protein

ATP: Adénosine triphosphate

bFGF: Fibroblast growth factor basique

BMP4: Bone morphogenetic protein 4

BMPs; Bone morphogenetic proteins

BPAG-1 et 2 : Antigène majeur de la pemphigoide bulleuse 1 et 2

BrdU: Bromodeoxyuridine

CAD11: Cadherin 11

CamKII: Ca 2+ /Calmodulin-dependent protein kinase II CD71: Cluster of differentiation 71 ou récepteur de la transferrine

Cdk4: Cyclin-dependent kinase 4

CFE: Colony-forming efficiency

CMH: complexe majeur d'histocompatibilité

Co-Smads: Common mediator Smads

CREB: cAMP response element binding protein

CSE: Cellules souches épidermiques

DDI et II: Dendrocytes dermiques de types I et II

DGCR8: DiGeorge syndrome critical region 8

DHICA: 5,6 dihydroxyindole-2 carboxylique

DOPA: 3,4-dihydroxyphénylalanine

DRO: Dérivés Réactifs de l'Oxygène

EB: Embryoid body

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EB: Epidermolyse bulleuse

EBD: EB dermolytiques ou dystrophiques

EBH: Epidermolyse bulleuses héréditaires

EBJ: EB jonctionnelles

EBS: EB épidermolytiques ou simples

EC: Embryonal carcinoma

ECVAM: European center for the validation of alternative methods

Edn3: Endothelin 3

Ednrb: Endothelin receptor type B

EEC: Ectrodactyly-ectodermal dysplasia-clefting

EGF: Epidermal growth factor

EGFR: Recepteur à l'EGF

EpiSC: Epidermal Stem Cells

EPU: Epidermal proliferative units

ES: Embryonic stem cells

FACS: Fluorescent-activated cell sorting

FDA: Food and Drug Administration

FGFs: Fibroblast growth factors

FIV Fécondation In Vitro

FMR1: Fragile X mental retardation 1

FZD3: Frizzled-3

GMP: Good manufacturing practice

GMPc: Cyclic guanosine monophosphate

HD: Hemidesmosomes

hES: Human embryonic stem cells

HK: Kératinocytes adultes humains

HLA: Human Leucocyte Antigen

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