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énstitutdes
ciencesdu gétaléUNIVERSITE PARIS-SUD 11
ÉCOLE DOCTORALE : Sciences du Végétal
DISCIPLINE : BIOLOGIE
THÈSE DE DOCTORAT
soutenue le 29/04/2011 parFrédéric FROTTIN
Afin d'obtenir le grade de
DOCTEUR de L'UNIVERSITE PARIS XI
Analyse intégrative du rôle de l'excision
de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes supérieursComposition du jury :
Pr. Pierre LE MARECHAL PRESIDENT DU JURY
Dr. Bruno FRANZETTI RAPPORTEUR
Dr. Dominique JOB RAPPORTEUR
Pr. Zach ADAM EXAMINATEUR
Dr. Carmela GIGLIONE DIRECTEUR DE THESE
Remerciements
Mon travail de thèse a été effectué au sein de l'Unité Propre de Recherche C.N.R.S.,Institut des Sciences du Végétal dans l'équipe Maturation, destinée cellulaire des protéines et
thérapeutique dans le cadre d'une allocation de recherche du ministère (MENRT) poursuivie par une allocation " fin de thèse » de l'ARC. Je remercie sincèrement le Dr Thierry Meinnel de m'avoir accueilli dans son équipe et de m'avoir soutenu et aidé dans la réalisation de mes projets par l'intermédiaire de discussions toujours fructueuses et pleines de sens. Je le prie de trouver ici l'assurance de ma profonde et respectueuse considération. J'exprime toute ma gratitude à Carmela Giglione, qui m'a confié ce projet de thèse passionnant, qui m'a supervisé durant toutes ces années, tout en préservant mon autonomie. Je la remercie de m'avoir transmis son enthousiasme pour la science. Je garde un souvenir ému de ses nombreux emails " peux tu venir STP » !Je remercie également chal
eureusement Jérôme Bignon et Miao de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (équipe J. Bakala) pour leur grande disponibilité, participation active à mon travail sur les lignées cellulaires humaines, pour m'avoir pleinement fait profiter de leurs connaissances et pour toutes ces discussions improvisées et si enrichissantes. Je remercie le Dr Bruno Franzetti et le Dr Dominique Job de m'avoir fait l'honneurd'être rapporteur de ma thèse, ainsi que le Pr Zach Adam et le Pr Pierre Le Maréchal d'avoir
accepté de participer à ce jury. Je tiens à remercier Aude Martinez, ma " co-thésarde » (et gardienne de fenêtres fermées !) dans le bureau 328. Je mentionne également le soutien indéfectibl e des troubadours de l'ISV passés et présents. Je remercie chaleureusement tous les membres de l'équipe : Sonia, Christelle, Michèlepour leur aide et soutien quotidien; Yann, Sylvain et José pour être toujours là pour détendre
l'atmosphère; Willy, Renata, Wojciech, Chiara, Imene, Margaux et Alex pour toutes ces discussions passonnantes et moments partagés. Je n'oublierai jamais non plus le Dr Vincent Ribrag et toute son équipe qui ont su me remettre sur pied dans les moments les plus difficiles. Je remercie également toutes les personnes qui m'ont apporté leur soutien, aide ou sympathie et dont il serait difficile d'en faire une liste exhaustive. Enfin je remercie Laurie pour sa patience et son soutien quotidien et mes parents sans qui tout cela n'aurait pas été possible.MERCI !
3Résumé
Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N- terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l'état stationnaire neprésentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d'une
maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l'Excision de la Méthionine N-
terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidusémergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où
une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont lesMEThionine AminoPeptidases
(METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles dedélétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans
tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la
cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd'hui un nombre croissant d'études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les base s moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analysesprotéomiques et métabolomiques, j'ai pu étudier les événements moléculaires précoces
associés à l'inhibition de la NME cytoplasmi que. J'ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j'ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisationfréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la
protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradationrapide. Ainsi, l'activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir
la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et leslignées de cellules humaines suggèrent l'existence d'un mécanisme ubiquitaire associé à la
NME. 4Abstract
The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision areMEThionine
AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases.Nevertheless, molecular mechanisms making NM
E an essential process is poorly understood
in particular in higher eukaryote cytoplasms. Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process. 5Table des matières
Remerciements 3
Résumé 4
Abstract 5
INTRODUCTION 14
I. Modifications protéiques 17
1. Les protéines, effecteurs dynamiques et régulées 17
2. La protéolyse, un mécanisme présent dès la synthèse 18
3. Modifications N-terminales des protéines 19
II. Les constituants de l'excision de la méthionine N-terminale 211. L'excision de la méthionine N-terminale 21
2. Les méthionine aminopeptidases 22
III. Implications et applications
thérapeutiques de l'excision de la méthionine N-terminale 311. L'excision de la méthionine N-terminale : une cible thérapeutique attractive 31
2. La méthionine aminopeptidase 2 : une cible, plusieurs effets 31
3. La méthionine aminopeptidase 1, une cible émergente 38
4. Effets physiologiques de la diminution de l'excision de la méthionine N-
terminale 39IV. Rôles physiologiques de l'excision de la méthionine N-terminale 49
1. L'excision de la méthionine N-terminale comme un prérequis 49
2. Les méthionine aminopeptidases, une régulation différentielle 51
3. L'excision de la méthionine N-terminale et le métabolisme de la méthionine 52
4. L'excision de la méthionine N-terminale et dégradation protéique 54
V. Problématiques, enjeux et objectifs du doctorat 651. Rappel général de l'état de l'art: de l'enzyme à l'organisme, du plus au moins
connu 652. Enjeux de la thèse 66
3. Objectifs du doctorat 67
RESULTATS 68
I. NME, glutathion et protéolyse : acteurs majeurs - Utilisation du modèle Arabidopsis thaliana 716
1. Introduction 71
2. Résumé de l'article : " Cotranslational Proteolysis Dominates Glutathione
Homeostasis to support Proper Growth and Development » (Annexe 1 et [1]) 723. Contrôles et expériences additionnels effectués 76
II. Aspects universels de l'excision de la méthionine N-terminale 911. Excision de la méthionine N-terminale et glutathion chez les archées et les
champignons 912. L'aide d'un modèle simplifié où l'étude de la NME est bien avancée, le
chloroplaste 943. Protéolyse et excision de la methionine N-terminale chez H. volcanii 101
4. L'excision de la méthionine N-terminale chez l'Homme, similitudes, différences
et valorisation 1065. Spécificité de substrats des méthionine aminopeptidases 120
DISCUSSION 126
Maturation, destinée cellulaire des protéines et thérapeutique 128 I. La NME, une spécificité de substrats très conservée 1291. Spécificité de substrats des METAPs procaryotiques 130
2. La spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques d'A. thaliana 130
3. Le cas de la spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques chez l'Homme 131
II. Evénements physiologiques associés à l'inhibition de l' excision de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes éi 1341. Le glutathion comme une cible physiologique de la NME 134
III. Le maintien de la méthionine N-terminale, signal de dégradation 1391. Le maintien de la méthionine N-terminale des protéines dans le cytoplasme des
eucaryotes supérieurs : un rôle déstabilisant 1392. L'influence de l'apparition de la méthionine N-terminale sur d'autres voies :
ubi quitination N-terminale et N-Į-acétylation 1413. La situation dans le chloroplas
te, un modèle d'ét ude de la NME 144 4. H. volcanii, un modèle d'étude des voies associées à la NME 146 IV. L'excision de la méthionine N-terminale chez les mammifères, cycle cellulaire et glutathion 1471. L'homéostasie rédox et le cycle cellulaire 148
2. D'autres cibles de la NME 151
V. La NME, processus ubiquitaire et voies associées conservées 1541. Le glutathion 154
72. La protéolyse
156VI. Conclusions - perspectives
156MATERIELS ET METHODES 159
I. Propagation et culture du matériel vivant utilisé 162 1.Arabidopsis thaliana 162
2.Saccharomyces cerevisiae 163
3.Haloferax volcanii 165
4. Lignées de cellules humaines 166
II. Biologie moléculaire et génétique 1691. Extraction de l'ADN génomique d'A. thaliana et génotypage 169
2. Génotypage de
loci de levures 1703. Sous clonage des METAPs cytoplasmique d'A. thaliana 170
4. Electrophorèses d'ADN
1745 . Extraction des transcripts des cellules humaines et PCRs quantitatives 174
6. Analyse du cycle cellulaire chez les cellules humaines 175
III. Biochimie des protéines 176
1. Extraction des protéines d'A. thaliana 176
2. Dosage des protéines 176
3. Electrophorèses des protéines - SDS-PAGE 177
4. Western blot 177
5. Détection des protéines carbonylées
1786. Séparation et dosage des peptides chez A. thaliana 179
7. Mesure de l'activité d'enzymes antioxydante chez A. thaliana 179
8. Expression et purification d'AtMETAP1A 180
9. Mesure de l'activité méthionine aminopeptidase 181
IV. Dosage de métabolites 184
1. Dosage du glutathion chez Arabidopsis
1842. Dosage du glutathion chez les cellules humaines
1843. Dosage du glutathion chez les HUVEC avec le CMFDA 185
4. Dosage des nicotinamides chez A. thaliana 186
5. Analyse des thiols chez A. thaliana 186
6. Quantification des métabolites et acides aminés chez A. thaliana 187
8 ANNEXE 1 " Cotranslational Proteolysis Dominates Glutathione Homeostasis to Support Proper Growth and Development » 189ANNEXE 2 "The proteomics of N-terminal methionine cleavage » 222
BIBLIOGRAPHIE 243
9Liste des figures et tableaux
Fig. 1 - Réactions enzymatiques de la voie d'excision de la méthionine N-terminale 22 Fig. 2 - Organisation en domaine des METAPs et classification 23 Fig. 3 - Alignement de séquences de différentes METAPs 25 Fig. 4 - Identité de séquences de différentes METAPs 26Fig. 5 - Structure des deux types de METAPs 26
Fig. 6 - La spécificité de substrats des METAPs 30Fig. 7 - Inhibiteurs des METAPs 37
Fig. 8 - Voies de blocage du cycle cellulaire proposées lors de l'inhibition desMETAPs humaines
44Fig. 9 - Autres conséquences physiologiques de l'inhibition de la METAP2 humaine 47
Fig. 10
- Multiples effets de l'inhibition de la NME cytoplasmique sur la croissance tumorale 48Fig. 11
- Interaction entre METAP2 et métabolisme de la méthionine 54Fig. 12
- Mécanisme catalytique des quatres classes majeures de protéases 55Fig. 13
- Voie ubiquitine-protéasome 57Fig. 14
- Règle de l'azote N-terminal à travers le vivant 58Fig. 15
- Dégradation des protéines substrats de la règle de l'azote N-terminal 60Fig. 16
- Ubiquitination et acétylation utilisent les mêmes groupements accepteurs 62Fig. 17
- Inhibition de la NME cytoplasmique chez A. thaliana et système biologique d'étude 72Fig. 18
- Le phénotype des plantes ayant leur NME cytoplasmique diminuée est similaire à celui du mutant rml1 74Fig. 19
- Analyse du développement du mutant metap1a cultivé en présence de 100 nM de fumagilline 78Fig. 20
- Etat d'oxydation protéique lors de la diminution de la NME cytoplasmique 79Fig. 21
- Activités ascorbate péroxydases et catal ases lors de la diminution de la NME cytoplasmique 80Fig. 22
- La NME et le fer dans la cellule 81Fig. 23
- Métabolisme de la cystéine et tests de complémentation. 84Fig. 24
- Siliques issues du croisement gr1 ; METAP1A X GR1 ; metap1a 86Fig. 25
- Test de transmission des gamètes 86Fig. 26
- Test de la sensibilité du double mutant gr1 ; metap1a à la fumagilline. 88Fig. 27
- Ratio des différents pyridines nucléotides chez A. thaliana 89quotesdbs_dbs22.pdfusesText_28[PDF] Calcul Algébrique
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