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UNIVERSITE PARIS-SUD 11

ÉCOLE DOCTORALE : Sciences du Végétal

DISCIPLINE : BIOLOGIE

THÈSE DE DOCTORAT

soutenue le 29/04/2011 par

Frédéric FROTTIN

Afin d'obtenir le grade de

DOCTEUR de L'UNIVERSITE PARIS XI

Analyse intégrative du rôle de l'excision

de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs

Composition du jury :

Pr. Pierre LE MARECHAL PRESIDENT DU JURY

Dr. Bruno FRANZETTI RAPPORTEUR

Dr. Dominique JOB RAPPORTEUR

Pr. Zach ADAM EXAMINATEUR

Dr. Carmela GIGLIONE DIRECTEUR DE THESE

Remerciements

Mon travail de thèse a été effectué au sein de l'Unité Propre de Recherche C.N.R.S.,

Institut des Sciences du Végétal dans l'équipe Maturation, destinée cellulaire des protéines et

thérapeutique dans le cadre d'une allocation de recherche du ministère (MENRT) poursuivie par une allocation " fin de thèse » de l'ARC. Je remercie sincèrement le Dr Thierry Meinnel de m'avoir accueilli dans son équipe et de m'avoir soutenu et aidé dans la réalisation de mes projets par l'intermédiaire de discussions toujours fructueuses et pleines de sens. Je le prie de trouver ici l'assurance de ma profonde et respectueuse considération. J'exprime toute ma gratitude à Carmela Giglione, qui m'a confié ce projet de thèse passionnant, qui m'a supervisé durant toutes ces années, tout en préservant mon autonomie. Je la remercie de m'avoir transmis son enthousiasme pour la science. Je garde un souvenir ému de ses nombreux emails " peux tu venir STP » !

Je remercie également chal

eureusement Jérôme Bignon et Miao de l'Institut de Chimie des Substances Naturelles (équipe J. Bakala) pour leur grande disponibilité, participation active à mon travail sur les lignées cellulaires humaines, pour m'avoir pleinement fait profiter de leurs connaissances et pour toutes ces discussions improvisées et si enrichissantes. Je remercie le Dr Bruno Franzetti et le Dr Dominique Job de m'avoir fait l'honneur

d'être rapporteur de ma thèse, ainsi que le Pr Zach Adam et le Pr Pierre Le Maréchal d'avoir

accepté de participer à ce jury. Je tiens à remercier Aude Martinez, ma " co-thésarde » (et gardienne de fenêtres fermées !) dans le bureau 328. Je mentionne également le soutien indéfectibl e des troubadours de l'ISV passés et présents. Je remercie chaleureusement tous les membres de l'équipe : Sonia, Christelle, Michèle

pour leur aide et soutien quotidien; Yann, Sylvain et José pour être toujours là pour détendre

l'atmosphère; Willy, Renata, Wojciech, Chiara, Imene, Margaux et Alex pour toutes ces discussions passonnantes et moments partagés. Je n'oublierai jamais non plus le Dr Vincent Ribrag et toute son équipe qui ont su me remettre sur pied dans les moments les plus difficiles. Je remercie également toutes les personnes qui m'ont apporté leur soutien, aide ou sympathie et dont il serait difficile d'en faire une liste exhaustive. Enfin je remercie Laurie pour sa patience et son soutien quotidien et mes parents sans qui tout cela n'aurait pas été possible.

MERCI !

3

Résumé

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N- terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l'état stationnaire ne

présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d'une

maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l'

Excision de la Méthionine N-

terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus

émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où

une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les

METhionine AminoPeptidases

(METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de

délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans

tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la

cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd'hui un nombre croissant d'études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les base s moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses

protéomiques et métabolomiques, j'ai pu étudier les événements moléculaires précoces

associés à l'inhibition de la NME cytoplasmi que. J'ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j'ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation

fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la

protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation

rapide. Ainsi, l'activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir

la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les

lignées de cellules humaines suggèrent l'existence d'un mécanisme ubiquitaire associé à la

NME. 4

Abstract

The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are

METhionine

AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases.

Nevertheless, molecular mechanisms making NM

E an essential process is poorly understood

in particular in higher eukaryote cytoplasms. Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process. 5

Table des matières

Remerciements 3

Résumé 4

Abstract 5

INTRODUCTION 14

I. Modifications protéiques 17

1. Les protéines, effecteurs dynamiques et régulées 17

2. La protéolyse, un mécanisme présent dès la synthèse 18

3. Modifications N-terminales des protéines 19

II. Les constituants de l'excision de la méthionine N-terminale 21

1. L'excision de la méthionine N-terminale 21

2. Les méthionine aminopeptidases 22

III. Implications et applications

thérapeutiques de l'excision de la méthionine N-terminale 31

1. L'excision de la méthionine N-terminale : une cible thérapeutique attractive 31

2. La méthionine aminopeptidase 2 : une cible, plusieurs effets 31

3. La méthionine aminopeptidase 1, une cible émergente 38

4. Effets physiologiques de la diminution de l'excision de la méthionine N-

terminale 39
IV. Rôles physiologiques de l'excision de la méthionine N-terminale 49

1. L'excision de la méthionine N-terminale comme un prérequis 49

2. Les méthionine aminopeptidases, une régulation différentielle 51

3. L'excision de la méthionine N-terminale et le métabolisme de la méthionine 52

4. L'excision de la méthionine N-terminale et dégradation protéique 54

V. Problématiques, enjeux et objectifs du doctorat 65

1. Rappel général de l'état de l'art: de l'enzyme à l'organisme, du plus au moins

connu 65

2. Enjeux de la thèse 66

3. Objectifs du doctorat 67

RESULTATS 68

I. NME, glutathion et protéolyse : acteurs majeurs - Utilisation du modèle Arabidopsis thaliana 71
6

1. Introduction 71

2. Résumé de l'article : " Cotranslational Proteolysis Dominates Glutathione

Homeostasis to support Proper Growth and Development » (Annexe 1 et [1]) 72

3. Contrôles et expériences additionnels effectués 76

II. Aspects universels de l'excision de la méthionine N-terminale 91

1. Excision de la méthionine N-terminale et glutathion chez les archées et les

champignons 91

2. L'aide d'un modèle simplifié où l'étude de la NME est bien avancée, le

chloroplaste 94

3. Protéolyse et excision de la methionine N-terminale chez H. volcanii 101

4. L'excision de la méthionine N-terminale chez l'Homme, similitudes, différences

et valorisation 106

5. Spécificité de substrats des méthionine aminopeptidases 120

DISCUSSION 126

Maturation, destinée cellulaire des protéines et thérapeutique 128 I. La NME, une spécificité de substrats très conservée 129

1. Spécificité de substrats des METAPs procaryotiques 130

2. La spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques d'A. thaliana 130

3. Le cas de la spécificité de substrats des METAPs cytoplasmiques chez l'Homme 131

II. Evénements physiologiques associés à l'inhibition de l' excision de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes éi 134

1. Le glutathion comme une cible physiologique de la NME 134

III. Le maintien de la méthionine N-terminale, signal de dégradation 139

1. Le maintien de la méthionine N-terminale des protéines dans le cytoplasme des

eucaryotes supérieurs : un rôle déstabilisant 139

2. L'influence de l'apparition de la méthionine N-terminale sur d'autres voies :

ubi quitination N-terminale et N-Į-acétylation 141

3. La situation dans le chloroplas

te, un modèle d'ét ude de la NME 144 4. H. volcanii, un modèle d'étude des voies associées à la NME 146 IV. L'excision de la méthionine N-terminale chez les mammifères, cycle cellulaire et glutathion 147

1. L'homéostasie rédox et le cycle cellulaire 148

2. D'autres cibles de la NME 151

V. La NME, processus ubiquitaire et voies associées conservées 154

1. Le glutathion 154

7

2. La protéolyse

156

VI. Conclusions - perspectives

156

MATERIELS ET METHODES 159

I. Propagation et culture du matériel vivant utilisé 162 1.

Arabidopsis thaliana 162

2.

Saccharomyces cerevisiae 163

3.

Haloferax volcanii 165

4. Lignées de cellules humaines 166

II. Biologie moléculaire et génétique 169

1. Extraction de l'ADN génomique d'A. thaliana et génotypage 169

2. Génotypage de

loci de levures 170

3. Sous clonage des METAPs cytoplasmique d'A. thaliana 170

4. Electrophorèses d'ADN

174
5 . Extraction des transcripts des cellules humaines et PCRs quantitatives 174

6. Analyse du cycle cellulaire chez les cellules humaines 175

III. Biochimie des protéines 176

1. Extraction des protéines d'A. thaliana 176

2. Dosage des protéines 176

3. Electrophorèses des protéines - SDS-PAGE 177

4. Western blot 177

5. Détection des protéines carbonylées

178

6. Séparation et dosage des peptides chez A. thaliana 179

7. Mesure de l'activité d'enzymes antioxydante chez A. thaliana 179

8. Expression et purification d'AtMETAP1A 180

9. Mesure de l'activité méthionine aminopeptidase 181

IV. Dosage de métabolites 184

1. Dosage du glutathion chez Arabidopsis

184

2. Dosage du glutathion chez les cellules humaines

184

3. Dosage du glutathion chez les HUVEC avec le CMFDA 185

4. Dosage des nicotinamides chez A. thaliana 186

5. Analyse des thiols chez A. thaliana 186

6. Quantification des métabolites et acides aminés chez A. thaliana 187

8 ANNEXE 1 " Cotranslational Proteolysis Dominates Glutathione Homeostasis to Support Proper Growth and Development » 189
ANNEXE 2 "The proteomics of N-terminal methionine cleavage » 222

BIBLIOGRAPHIE 243

9

Liste des figures et tableaux

Fig. 1 - Réactions enzymatiques de la voie d'excision de la méthionine N-terminale 22 Fig. 2 - Organisation en domaine des METAPs et classification 23 Fig. 3 - Alignement de séquences de différentes METAPs 25 Fig. 4 - Identité de séquences de différentes METAPs 26

Fig. 5 - Structure des deux types de METAPs 26

Fig. 6 - La spécificité de substrats des METAPs 30

Fig. 7 - Inhibiteurs des METAPs 37

Fig. 8 - Voies de blocage du cycle cellulaire proposées lors de l'inhibition des

METAPs humaines

44
Fig. 9 - Autres conséquences physiologiques de l'inhibition de la METAP2 humaine 47

Fig. 10

- Multiples effets de l'inhibition de la NME cytoplasmique sur la croissance tumorale 48

Fig. 11

- Interaction entre METAP2 et métabolisme de la méthionine 54

Fig. 12

- Mécanisme catalytique des quatres classes majeures de protéases 55

Fig. 13

- Voie ubiquitine-protéasome 57

Fig. 14

- Règle de l'azote N-terminal à travers le vivant 58

Fig. 15

- Dégradation des protéines substrats de la règle de l'azote N-terminal 60

Fig. 16

- Ubiquitination et acétylation utilisent les mêmes groupements accepteurs 62

Fig. 17

- Inhibition de la NME cytoplasmique chez A. thaliana et système biologique d'étude 72

Fig. 18

- Le phénotype des plantes ayant leur NME cytoplasmique diminuée est similaire à celui du mutant rml1 74

Fig. 19

- Analyse du développement du mutant metap1a cultivé en présence de 100 nM de fumagilline 78

Fig. 20

- Etat d'oxydation protéique lors de la diminution de la NME cytoplasmique 79

Fig. 21

- Activités ascorbate péroxydases et catal ases lors de la diminution de la NME cytoplasmique 80

Fig. 22

- La NME et le fer dans la cellule 81

Fig. 23

- Métabolisme de la cystéine et tests de complémentation. 84

Fig. 24

- Siliques issues du croisement gr1 ; METAP1A X GR1 ; metap1a 86

Fig. 25

- Test de transmission des gamètes 86

Fig. 26

- Test de la sensibilité du double mutant gr1 ; metap1a à la fumagilline. 88

Fig. 27

- Ratio des différents pyridines nucléotides chez A. thaliana 89quotesdbs_dbs22.pdfusesText_28

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