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Cours biochimie BTS_ABM1 2016-2017 2.2.1- Vitesse_initiale - Page 1 sur 4 - 2- ENZYMOLOGIE 2.2- LA CINÉTIQUE ENZYMATIQUE 2.2.1- EXPRESSIONS DE LA VITESSE INITIALE La cinétique correspond à l'étude de la vitesse d'une réaction ici enzymatique donc catalysée par une enzyme : SEP ou E+SE+P E : enzyme ; S : substrat ; P : produit On n'étudiera que les réactions enzymatiques à un seul substrat et de stoechiométrie 1 entre S et P. La vitesse de la réaction reflète le travail de l'enzyme. Cette vitesse est d'autant plus grande qu'il y a d'enzyme dans la solution de travail. Ainsi on comprend que la vitesse enzymatique que l'on peut mesurer reflète la quantité d'enzyme présente, grandeur difficilement quantifiable. 1. Notion de vitesse initiale 1.1. Suivi d'une réaction enzymatique Soit la réaction enzymatique catalysée par l'uréase : + 2 H2O uréase ¾¾¾® CO32- + 2 NH4+ Substrat Produits Remarque : l'uréase est une hydrolase, elle fonctionne donc sans cofacteur. Expérimentalement, on met dans un erlenmeyer placé dans un bain thermostaté à 25°C : • une solution d'urée de concentration initiale connue ([S]0) • un tampon assurant un pH constant au cours de la réaction • une solution d'enzyme dans le tampon Toutes les minutes, on prélève 1 mL de milieu réactionnel (MR). Après avoir arrêté la réacti on, on dose les ions amm onium NH4+ présents par dosage colorimétrique. On obtient le tableau ci-dessous à partir duquel on peut tracer l'évolution de la concentration en produit [P] en fonction du temps t. 1.2. Étude de [P] = f(t) 1.2.1. Résultats expérimentaux : le tracé t (min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 [P] (µmol/mLMR) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 2,75 3,1 3,3 3,5 3,6 3,65 Tracer la courbe [P] = f(t). Le fait de suivre l'apparition du produit en fonction du temps et d'en tracer la courbe, constitue une cinétique : cinét ique de formation du produit dans des conditions opératoires définies : • [S] fixée au départ • [E] fixée et constante • Pas d'effecteurs • T°C fixée (ici 25°C) • t varie • pH fixé par le tampon
Cours biochimie BTS_ABM1 2016-2017 2.2.1- Vitesse_initiale - Page 2 sur 4 - 00,511,522,533,54024681012Concentrationenproduit(µmol/mLdemilieuréactionnel)Temps(enminutes)Suivicinétiquedel'uréase
Cours biochimie BTS_ABM1 2016-2017 2.2.1- Vitesse_initiale - Page 3 sur 4 - 1.2.2. Analyse de la courbe La vitesse d'apparition du produit P est égale à la pente de la courbe en tout point : !=$[&]$( a. Partie OA La courbe OA est une droite passant par l'origine. On dit que la courbe est linéaire. Cela signifie que la pente qui correspond à la vitesse de réaction est constante. La période pendant laquelle la vitesse de réaction est constante définit les conditions initiales. Dans les conditi ons initiales, la vitesse d'une réaction enzyma tique est constante et s'appelle la vitesse initiale. !)=(+,+-)(→0 b. Partie AB La courbe s'incurve. Dans cette partie, la vitesse de réaction diminue. c. Partie BC La courbe est parallèle à l'axe des abscisses. La concentration en produit n'évolue plus en fonction du temps : la vitesse de réaction est nulle. 1.2.3. Détermination de la vitesse initiale De manière générale, la détermination des vitesses d'une réaction enzymatique se fait dans les conditions initiales : on détermine donc graphiquement la vitesse initiale !) à partir des courbes [,]=1(-)ou [2]=1(-) en tenant compte du fait qu'une vitesse est une grandeur positive. 2. Expression de la vitesse initiale et suivi de purification 2.1. Activité enzymatique ou catalytique (z) L'activité catalytique d'une enzyme correspond au nombre de mole de substrat (S) transformé par seconde (katal). L'unité internationale (U) d'activité catalytique définie en 1960 est encore utilisée mais tend à être remplacée par l'unité cohérente : le katal (abréviation : kat) • U ou UI : µmol de substrat consommé par minute dans des conditions définies. • katal : mol de substrat consommé par seconde dans des conditions définies. 1 UI = 1 µmol·min-1 = 16,67 nmol·s-1 = 16,67 nkat 1nkat = 60·10-3 U [S]0 [S] [P] Concentration Temps
Cours biochimie BTS_ABM1 2016-2017 2.2.1- Vitesse_initiale - Page 4 sur 4 - 2.2. Concentration d'activité catalytique (b) La concentration d'activité catalytique correspond au nombre de mole de substrat (S) transformé par seconde par un litre de solution enzymatique. La mesure d'une concentration d'activi té cat alytique ne se conçoit qu'avec l'indication des conditions du système d'essai (nature et concentration du substrat, pH, température, effecteurs). Le volume auque l on se rapporte e st le volume de solution contenant l 'enzyme (sérum, érythrocytes, surnageant...) et non celui du milieu réactionnel où se fait la mesure. b = Activité catalytiqueVolume d'enzyme= zVenzyme Unité de b : µmol·min-1·mL-1 (unité usuelle) ou nkat·L-1 (unité cohérente) 2.3. Activité catalytique spécifique (zsp) Spécifique signifie " rapporter à la masse ». L'activité (catalytique) spécifique correspond au nombre de m ole de s ubstrat transformé pa r seconde et par kg de protéines (kat·kg-1). C'est l'activité catalytique d'une enzyme divisée par la masse de la protéine enzymatique elle-même, protéine purifiée ou pure. Cette dernière va leur n'étant, en général, pas connue, on rapporte l'activité à la masse de protéines contenue la solution. 345=ActivitécatalytiqueMassedeprotéines=ActivitécatalytiqueVolumed'enzyme×concentrationmassiqueenprotéines Zsp=OP5QR(é)ST4=zρprotéines×Venzyme=bρprotéines Unité de zsp : µmol·min-1·mg-1 protéines ou en kat·kg-1 protéines 2.4. Activité spécifique molaire (zm) L'activité spécifique molaire correspond au nombre de mole de substrat transformé par seconde et par mole d'enzyme. C'est l'activité catalytique z rapportée à la quantité de matière de la protéine enzymatique exprimée en mole. Cela suppose une enzyme totalement purifiée. zm=ActivitéenzymatiqueNombredemolesd'enzymes=znenzyme=OXTSYZ[T×\TSYZ[T=]XTSYZ[T zm=O45×^TSYZ[T ^TSYZ[T: masse molaire de l'enzyme pure Unité de zm : kat·mol-1 d'enzyme (moles de substrat transformé par mole d'enzyme et par seconde). Elle permet de déte rminer le nombre de mol écules de substrat transformées par une molécule d'enzyme par unité de temps. 2.5. Suivi de purification d'enzyme 2.5.1. Rendement de la purification Rendement=activitétotalefinaleactivitétotaleinitiale×100=(O45×P5)c)Sde(O45×P5))S)()de×100 2.5.2. Enrichissement dû à la purification Enrichissement=activitéspécifiquefinaleactivitéspécifiqueinitiale
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