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Cinétique Enzymatique Michaélienne

1.La réaction enzymatique E

S <=> P

La vitesse de la réaction nous donne:

v = d[P] / dt = d[S] / dt

Vi = vitesse initale

•Influence de la concentration en Enzyme

Vi varie en fonction de la [E] et [S] d'où:

vi = f([E] . [S]) [ E ]Vi [ E 1 ]V1 [ E 2 ]V2 [ E 3 ]V3 => vi = f([E]) Lorsque l'on a [S] élevé, on a une vitesse initiale proportionnelle à la concentration en Enzyme => [S] élevée = vi = k . [E]

Remarque sur la courbe:

1: [E] = 0 --> vi ~ 0 --> la vitesse est négligeable

2: la zone linéaire stagne au bout d'un certain temps ( - - - - ). Si on augmente le concentration en

substrat, alors la zone linéaire reprend.

Parfois, à partir d'une certaine concentration, la concentration en enzyme diminue, ce qui ne donne plus

de zone linéaire.

Si on a: vi = k . [E] => [E] = 1/k . vi

On exprime [E] en " concentration catalytique ». •Influence de la concentration en Substrat 1

S <==> P

2 On mesure Vi, ici [P] est négligeable, on peut presque écrire S --> P. [S]Vi [S]1V1 [S]2V2 => vi = f([S])

Ici on ne peut pas écrire vi = k . [S]

Vm = vi ([S] = ∞)

vi = k . [S] n L'ordre de la réaction varie en fonction de la concentration en Substrat

Ordre 1Ordre 0

La cinétique chimique ne s'applique pas toujours à l'enzymologie. •Hypothèse de Michaelis k1 k3

S + E <==> ES <==> E + P

k2 complexe Enzyme - Substrat •Hypothèse de Michaelis implique la Phase stationnaire ici vi " stationnaire » --> [ES] = constante => vi = constante vi = d[P] / dt = d[S] / dt vi = k3 . [ES] La relation de Michaelis s'applique que pendant la phase stationnaire.

0 --> t1: phase préstationnaire, environ quelques secondes

=> inaccessible par des mesures classiques t2 --> +∞: phase post-stationnaire vi = d[P] / dt =constante = phase stationnaire Si la phase stationnaire n'est pas visible, vi = tangente à la courbe

2.L'équation de Michaelis Elle ne s'applique qu'en phase stationnaire

vi = constante il faut que [P] soit négligeable donc E + P --XX> ES k1 k3

E + S <==> E-S <==> E + P

k2 •La constante de Michaelis v1 = k1 . [E] . [S] v2 = k2 . [ES] v3 = k3 . [ES] or -d[S] / dt = -k2 . [ES] + k1 . [E] . [S] vitesse de disparition du substrat: vi = d[S] / dt = k1 . [E] . [S] - k2 . [ES] vitesse d'apparition du produit: d[P] / dt = k3 . [ES]Or - d[S] / dt = d[P] / dt

D'où:

k1 . [E] . [S] - k2 . [ES] = k3 . [ES] k1 . [E] . [S] = k3 . [ES] + k2 . [ES] = (k3 + k2) . [ES] => (k3 + k2)/ k1 = ([E] . [S]) / [ES] or k1, k2, k3 sont des constantes de vitesse d'où: (k3 + k2)/ k1 = KM KM = ([E] . [S]) / [ES]

Analogie avec l'équilibre chimique:

k1 k3

E + S <==> E-S <==> E + P

k2

KA = [ES] / ([E] . [S])etKD = ([E] . [S]) / [ES]

Donc KM est considéré comme une constante de dissociation " apparente » du complexe E-S.

K3 = s-1

nombre de molécules de Substrat transformées par un molécule d'Enzyme par seconde

Produit formés

•Équation de Michaelis [Et] = [E] + [ES] KM = ([E] . [S]) / [ES] --> [E] = (KM . [ES]) / [S] remplaçons: [Et] = ( (KM . [ES]) / [S] ) + [ES] multiplions par [S] => [Et] . [S] = (KM . [ES]) + [ES] . [S] => [Et] . [S] = [ES] . (KM + [S]) => [ES] = ( [Et] . [S] ) / (KM + [S]) multiplions par k3 => k3 . [ES] = k3 . ( ( [Et] . [S] ) / (KM + [S]) ) or vi = k3 .[ES] => k3 . [Et] = vi max ce qui nous donne: vi = (vi max . [S]) / ( KM + [S])Relation de Michaelis vérification de la courbe expérimentale:

S très grand (par rapport ) KM) S>>KM

vi = (vi max . [S]) / (KM + [S]) alors vi = vi max

S très petit S<< KM

vi = (vi max . [S]) / (KM + [S]) = (v max . [S]) / KM or v max /KM Ainsi la relation de Michaelis est conforme au modèle

Vi = vi max / 2

vi = (v max . [S] ) / (KM + [S]) cas particulier: v max / 2 = v max . [S] / KM + [S] => KM + [S] = 2[S] donc KM = [S]

KM est la concentration en substrat quand

vi = v max /2

KM => [S] quand v i = v max / 2

KM => constante d'association partielle

KM => (k2 + k3) / k1 = ([E] . [S]) / [ES]

•Détermination de KM et Vm

Lineweaver et Burk (double inverse)

vi = (v max . [S]) / (KM + [S])1/ v i = (KM + [S]) / (V max . [S])

1/vi = ( (KM / v max) . (1/[S]) ) + ( ([S] / [S] ) . (1/v max) )

1/vi = (KM / v max) . (1/[S]) + (1/V max)

1/vi = f (1/[S])

1/[S] = 0

remplaçons:

1/vi = 1/v max

d'autre part:

1/vi = 0

0 = (KM / v max) . (1/ [S]) + (1/V max)

0 = KM / [S] + 1

=> KM / [S] = -1 d'où: 1/[S] = -1/KM

Cette méthode a un défaut: très souvent il faut négliger un point, celui qui a la plus petite [S].

Donc la droite retenue est nécessairement celle où on néglige ce point extrême. Eadie

Vi = (V max . [S]) / (KM + [S])

(vi . (KM + [S]) ) / [S] = V max vi = (KM / [S]) + Vi = Vmax=> Vi = (-Vi / [S]) . KM + Vmax y = -x . a + b

Eisenthal et Cornish-Bowden

Méthode qui possède le moins

de " biais »

3.Calculs et significations des "constantes" en enzymologie

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