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Principes de Chromatographie Effectuer la HPLC analytique dans des conditions standards • Ajuster la Passer à une colonne prep HPLC • Choisir une

Introduction

X. Bataille - ENCPB - 2008

Principe de la CLHP

Séparation de constituants dans un

mélange complexeMise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant)Analyse qualitativeAnalyse quantitative

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Principe

X. Bataille - ENCPB - 2008Schéma

X. Bataille - ENCPB - 2008CLHP

Apparition: années 1950Chromatographie:

séparation et quantificationLiquide: travail en solutionHaute performance:

Grande efficacité de la

séparation

X. Bataille - ENCPB - 2008

Comparaison CPG-CLHPCPG: Chromatographie en Phase

Gazeuse : ?composés volatils,

?faibles masses molairesCLHP: ?toutes molécules trouvent un solvant pour y être dissoutes : méthode universelle

X. Bataille - ENCPB - 2008

Exemple de chromatogramme

Rétention

différée

X. Bataille - ENCPB - 2008

Performance - EfficacitéNombre de plateaux théoriquesN> 2000 2 2 0 1/2

16 5,54

r r tht tNw w( ) ( )

X. Bataille - ENCPB - 2008

Résolution

R ~ 1,5

0 0 1/2 1/2

2 1,18

A B A BA B A Br r r rt t t tRw w w w

X. Bataille - ENCPB - 2008Asymétrie

As = A/B

X. Bataille - ENCPB - 2008

Autres paramètres

Temps de rétention réduit : t"

R= t R- t 0

Facteur de capacité :

00 2 2tttk R- 00 1 1tttk R-

X. Bataille - ENCPB - 2008

Temps mort (t

mou t 0) Temps que met un produit pour traverser la colonne

sans être retenu.Se calcule si on connaît la porositéde la colonne, définie par :Le temps mortdépend des caractéristiques de la colonne: la longueur(l), son diamètre(2r), sa porosité(e) et du débitimposé par la pompe (d).

3 -1

éluant

m 2 2 colonne vide / cm .min /min

ε = / cm

π /cm´=´ ´V

d t V l r 2 m l r t d

X. Bataille - ENCPB - 2008

Autres paramètres

Sélectivité :Sous réserve de certaines approximations : NkkR S -=1""1 41aa
,,12RRtt= a

X. Bataille - ENCPB - 2008Objectif

Séparation individuelle de tous les

constituants d"un mélangeDeux facteurs :?Miscibilité dans la phase mobile ?Interaction (affinité) avec la phase stationnaire

X. Bataille - ENCPB - 2008

Principe d"une

séparation

Temps d"analyse:

minimalPerformance: maximale

Constitution de la chaîne

X. Bataille - ENCPB - 2008

Les pompes

Délivrer un débit

constantsous une pressionélevée, constante

X. Bataille - ENCPB - 2008

Vanne d"injection

X. Bataille - ENCPB - 2008

Boucle d"injection

X. Bataille - ENCPB - 2008

Colonnes

X. Bataille - ENCPB - 2008

Détecteur UV

X. Bataille - ENCPB - 2008

Détecteur UV

X. Bataille - ENCPB - 2008Détecteur

réfractométrique

X. Bataille - ENCPB - 2008

Détecteur fluorimétrique

X. Bataille - ENCPB - 2008

Constitution de la

colonne Colonne remplie de billesBilles de silice tapissées d"un revêtement

X. Bataille - ENCPB - 2008Billes

X. Bataille - ENCPB - 2008

Phase inverse (RP)

/ phase normale

Complémentarité

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Physico-chimie

de la rétentionCompromis entre:?phase stationnaire ?phase mobile

Interactions intermoléculaires

EI Q EI Q

X. Bataille - ENCPB - 2008

Interactions

intermoléculaires

X. Bataille - ENCPB - 2008

Moment dipolaire

X. Bataille - ENCPB - 2008

Autres moments

X. Bataille - ENCPB - 2008

Interaction dipôle-dipôle

X. Bataille - ENCPB - 2008

Interaction dipôle-dipôle

X. Bataille - ENCPB - 2008

Polarisabilité

X. Bataille - ENCPB - 2008

Interaction dipôle

permanent-dipôle induit

X. Bataille - ENCPB - 2008

Dispersion

X. Bataille - ENCPB - 2008

Interactions

de Van der Waals

X. Bataille - ENCPB - 2008

Liaison hydrogène

X. Bataille - ENCPB - 2008Bilan

X. Bataille - ENCPB - 2008

" Magic » LogP octanol/eau

Constante de partage octanol / eau

i,octanol i i,eau

P = C

C OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH HO H HO H HO H HO H HO H H OH OH OH OH OH OH OH OH OH?

X. Bataille - ENCPB - 2008

Version Chemsketch

(ACDLABS)

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LogP par la méthode de Villar

(Int. J. Quantum Chem., 44444444, 203 (1992))

X. Bataille - ENCPB - 2008

LogP / Villar en PM3

X. Bataille - ENCPB - 2008

LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen (J. Computational Chem., 9999, 80 (1988))

X. Bataille - ENCPB - 2008

Influence de la polarité

de l"éluantNotion de force éluante : ?Influence de la proportion de solvant apolaire

Isothermes de van"t Hoff

i i i i ln k" ln + +

H SRT R

D ° D °

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Préparation d"une séparation

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Choix de l"éluant

X. Bataille - ENCPB - 2008

Gradient d"éluant

X. Bataille - ENCPB - 2008

Gradient

d"éluant

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Couplages

Identifier les produits sortants par : ?Spectrométrie de masse ?Résonance magnétique nucléaire ?Spectroscopie Infra-Rouge

X. Bataille - ENCPB - 2008

Couplage CLHP-SM

X. Bataille - ENCPB - 2008

Couplage CLHP-RMN

X. Bataille - ENCPB - 2008

Couplage CLHP-IR

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Optimisation d"une

séparation tanalyse le plus petit possible

Résolution: 1,7 > R > 1,4Asymétrie: centrée sur 1PerformanceélevéeRobustesse : une légère modification

des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l"analyse.

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Facteurs d"optimisation Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle)Débit - PressionEluant (%polaire-apolaire, pH)Température

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Efficacité

Débit

Anisotropie

d"écoulement

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Van-Deemter / Knox

Hauteur Equivalente en Plateaux

Théoriques :

NLH= 3

Van Deemter : .Knox : . .

VD VD VD Kn

Kn KnB

H A C v

BH A v C vv= + +

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Efficacité d"une colonne (nombre de plateaux

théorique):Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) : avec 222

1654,5)

wdsRRRtttN222"16"54,5") wdsRRR efftttN 0 "ttt RR-

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Perte de charge

X. Bataille - ENCPB - 2008

Exemple : optimisation

de la séparation des bases de l"ADN

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Stabilisation

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Choix judicieux des

concentrations

X. Bataille - ENCPB - 2008

Spectre UV-visible

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Débit

X. Bataille - ENCPB - 2008% MeOH

X. Bataille - ENCPB - 2008

Température

X. Bataille - ENCPB - 2008Bilan

X. Bataille - ENCPB - 2008

Bilan de l"optimisation

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Applications de la CLHP

AnalytiqueCLHP Analytique ?Gamme d"étalonnage

?Ajouts dosés ?Etalon interneCLHP préparative?Dérivation en sortie ?Boucle d"injection à gros volumequotesdbs_dbs21.pdfusesText_27

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Introduction

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Principe de la CLHP

Séparation de constituants dans un

X. Bataille - ENCPB - 2008

X. Bataille - ENCPB - 2008Principe

X. Bataille - ENCPB - 2008Schéma

X. Bataille - ENCPB - 2008CLHP

Apparition: années 1950Chromatographie:

Grande efficacité de la

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Comparaison CPG-CLHPCPG: Chromatographie en Phase

Gazeuse : ?composés volatils,

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Exemple de chromatogramme

Rétention

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16 5,54

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Résolution

R ~ 1,5

0 0 1/2 1/2

2 1,18

A B A BA B A Br r r rt t t tRw w w w

X. Bataille - ENCPB - 2008Asymétrie

As = A/B

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Autres paramètres

Temps de rétention réduit : t"

Facteur de capacité :

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Temps mort (t

éluant

ε = / cm

π /cm´=´ ´V

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Autres paramètres

X. Bataille - ENCPB - 2008Objectif

Séparation individuelle de tous les

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Principe d"une

Temps d"analyse:

Constitution de la chaîne

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Les pompes

Délivrer un débit

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Vanne d"injection

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Boucle d"injection

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Colonnes

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Détecteur UV

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Détecteur UV

X. Bataille - ENCPB - 2008Détecteur

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Détecteur fluorimétrique

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Constitution de la

X. Bataille - ENCPB - 2008Billes

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Phase inverse (RP)

Complémentarité

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Physico-chimie

Interactions intermoléculaires

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Interactions

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Moment dipolaire

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Autres moments

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Interaction dipôle-dipôle

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Interaction dipôle-dipôle

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