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UNIVERSITE DES ANTILLES ET DE LA GUYANE NOM :
UFR SCIENCES EXACTES ET NATURELLES
PRENOM :
Licence STS - Mention BGS - UEP 1.3
Enzymologie
Plier le coin
Examen - semestre 3
Janvier 2007 - 1h30
Coller ici
1 - Etude de la phosphatase alcaline
A - (25 mn - 5 points) On mesure la vitesse initiale de la réaction catalysée par lesphosphatases alcalines contenues dans un échantillon de sérum. Deux substrats sont utilisés,
le 2glycérophosphate et le nitro-4-phényl-phosphate. Les vitesses initiales de transformation des substrats en fonction de concentration différentes de substrats sont les suivantes :Vitesses initiales en mmole.mn
-1 Concentrations en 2-glycérophosphate nitro-4-phényl-phosphate mole.l-1 1/S 1/V 1/V
1.25 10-4 0.8104 0.083 10-3 12 103 0.100 10-3 10 103
2.50 10-4 0.4104 0.105 10-3 9.5103 0.160 10-3 6 103
5.00 10-4 0.2104 0.120 10-3 8.3103 0.250 10-3 4 103
Déterminer pour ce sérum les Km apparents des phosphatases alcalines pour chacun des deux substrats. Justifier pour quel substrat l"affinité des phosphatases alcalines est la plus forte.Répondre sur la courbe.
B - (10 mn - 3 points) On recommence la mesure des vitesses initiales en fonction de la concentration en nitro-4-phényl-phosphate en rajoutant dans chaque tube une quantitéidentique de 2-glycérophosphate. Les résultats obtenus sont représentés suivant le tracé de
Lineweaver-Burk (voir ci-dessous). Quel est l"effet du 2-glycérophosphate sur la cinétique de transformation du nitro-4-phényl-phosphate ? Argumenter la réponse. Nom :Prénom :
2 - ( 30 mn - 6 points) Activité molaire spécifique
Soit 5 ml de b-galactosidase de concentration 0,2 mg par ml qui hydrolysent en 10 mn 0.8 g de lactose à pH 8 et à 25°C. On donne M b-galactosidase = 135000. On suppose la masse molaire de lactose connue.Calculer l"activité en :
mmoles/mn/mlMM lactose = (180X2)-18 = 342
0.8 x106
342 x10 x5 = 46.8
1En déduire AS en UI/mg
0.8 x106
342 x10 x5 x 0.2 = 234
1 moles/s/ml 0.8342 x10 x5 x60 = 0.78 10
-6 1 En déduire Activité spécifique en kat /mg 0.8342 x10 x5 x60 x0.2 =
3.9 10-6
1 moles/s/mole0.8 x 103 x 135000
342 x10 x5 x60 x0.2 = 526
1 En déduire Activité molaire spécifique (AMS) en kat/mole (soit en s -1) 5261
3 - (20 mn - 5 points) Dosage enzymatique du galactose par la galactose déshydrogénase
La galactose déshydrogénase oxyde le D-galactose en D-galactonolactone. La formation du cofacteur réduit NADH+H+ est suivie par spectrophotométrie. Ecrire la réaction (les formules chimiques ne sont pas demandées) galactose déshydrogénase D-galactose + NAD+ _______________ D-galactonolactone + NADH2 .5Avec 2
glycérophosphateSans glycérophosphate
1/[S] Nitro-4-phényl-
104 mole-
1/v mmole 1.mnRéponse :
Le 2-glycérophosphate est un inhibiteur
compétitif du nitro-4-phényl-phosphate pour les phosphatases.En effet en présence de 2-
glycérophosphate, la cinétique du nitro-4-phényl-phosphate par les phosphatases montre :Le Vmax reste inchangé
Le Km augmente.
D"après les courbes d"absorption du cofacteur sous forme réduite ou oxydée ci-dessous, qu"elle
est la longueur d"onde choisie pour faire le dosage. Justifier la réponse. Le dosage du galactose urinaire d"un patient est réalisé comme suit : Dans une cuve de spectrophotomètre de trajet optique de 1cm on dépose :3 ml de tampon triéthanolamine à pH 7.5, 0.1 ml de solution contenant le NAD+, 0.2 ml d"urine
préalablement diluée au 1/10. On homogénéise, l"absorbance lue est : A1 = 0.15Puis on dépose 0.02 ml de galactose déshydrogénase, on homogénéise, on laisse agit 20 mn
L"absorbance lue est alors A2 = 0.65
A la longueur d"onde choisie, le coefficient d"extinction molaire est de 6.3 103 mole-1.l.cm-1
Que représente la lecture A1 ? 0.2
Représente le témoin avant la transformation du galactose, l"enzyme étant absentQue se passe-t-il quand on ajoute 0.02 ml de galactose déshydrogénase ? 0.3
Le galactose est transformé, le NADH2 apparaît.En déduire :
La concentration en galactose dans le cuve : 1 C Tube = (0.65 - 0.15) / 1 x 6, 3 103 = 7.9 10-5 mole / l La concentration en galactose de l"échantillon déposé (0.2 ml d"urine diluée au 1/10) C Echantillon déposé = (0.65 - 0.15) x 3.32 / 0.2 x 1 x 6, 3 103 = 1.32 10-3 mole / l 1 La concentration en galactose dans l"urine du patient C Urine = (0.65 - 0.15) x 3.32 / 0.2 x 1 x 6, 3 103 = 1.32 10-2 mole / l 14 - Définitions (5 mn - 1 point)
Qu"appelle-t-on cofacteurs vrais et cofacteurs prosthétiques ? 0.6 Donner un exemple pour chacun. 0.4Un cofacteur vrai est un cofacteur qui s"associe à l"enzyme au moment de la réaction et qui s"en
détache après la réaction