permet d'observer des cellules vivantes sans coloration donc sans qu'il y ait eu de Ou bien on fait passer l'eau de l'état liquide à l'état solide = technique de cependant en histologie lorsqu'il s'agit d'étudier des groupements cellulaires
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développées pour étudier les divers aspects de la cellule : La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des *Le bleu de Trypan, qui ne peut pénétrer dans des cellules vivantes, mais qui colore les
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de techniques appropriés qui ont été perfectionnés au fur et à mesure du temps et le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet gauche) et avec un microscope à contraste de phase (à droite) Matériel non coloré
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Chapitre : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE
1ère PARTIE :
METHODES D'ETUDE DE LA MORPHOLOGIE DES CELLULES
La plupart des méthodes sont basées sur l'emploi des microscopes, la taille des cellules et de leurs
constituants est en effet généralement trop petite pour qu'il soit possible de les observer à l'oeil nu.
Il existe toute une gamme de microscopes.
1. Les microscopes
1.1. Les microscopes à lumière ou microscopes photoniques
Il existe divers types de microscopes à lumière : - les uns permettent l'observation directe de structures dont les dimensions sont de l'ordre de 0,2µm ce sont les microscopes par transmission ;
- les autres microscopes donnent des informations indirectes sur l'ultrastructure des cellules =microscope à lumière polarisée, microscope à fond noir et microscope à contraste de phase.
- le microscope confocal à balayage1.1.1. Microscopes par transmission
Le microscope le plus courant utilise la lumière visible (lumière blanche constituée de plusieurs
longueurs d'onde) qui est transmise directement sur la prépa biologique.Ces microscopes sont équipés de système de lentilles qui condensent la lumière sur la préparation à
observer. Les échantillons biologiques observés sont traversés par la lumière.Tous les microscopes sont caractérisés par leur pouvoir séparateur = pouvoir de résolution c'est à
dire la distance limite appréciable entre 2 points = aussi limite de résolution. Pour l'oeil humain, cette distance limite appréciable est de 100 à 200 µm. Un microscope photonique à transmission distingue des objets tout au plus distant de 0,2 µm. Le pouvoir séparateur d'un microscope est donné par la formule d'Abbe : e = (0,61.l) / (n.sin u) avec e = distance limite appréciable = limite de résolution l = longueur d'onde de la lumière utilisée (400 nm = violet ---> 800 nm = rouge) n = indice de réfraction du milieu transparent u = moitié de l'angle d'ouverture du cône lumineux entrant dans l'objectif0,61 = constante
Pouvoir séparateur élevé <-----> distance limite appréciable petiteD'après cette formule on voit que le pouvoir séparateur est d'autant plus grand c'est à dire la
distance limite appréciable plus petite que la longueur d'onde des radiations utilisées est petite
ou que u et n sont plus grands. * à propos de la longueur d'onde utilisée :En général, une radiation possédant une longueur d'onde donnée ne peut être employée pour
examiner des détails structuraux beaucoup plus petit que sa propre ?? Ce principe impose donc une limite fondamentale au pouvoir séparateur du microscope photonique. La limite extrême de résolution d'un microscope photonique est donc fixée par la longueur d'onde de la lumière, qui varie d'environ 0,4 µm à 0,7 µm selon sa couleur.Concrètement, une bactérie ou une mitochondrie qui mesurent environ 0,5 µm de largeur sont les
plus petits objets clairement observables au microscope photonique. Des détails plus fins sont masqués par des effets de diffraction optique. * On peut jouer sur n et sur sin u :Cependant, cette précision peut être ramenée à 0,2 µm (200 nm) lors de l'utilisation d'un
objectif à immersion.- On intercale entre l'objectif et la préparation à observer une goutte d'huile dont l'indice de réfraction
est voisin de celui du verre : n augmente donc e diminue.- De plus, il n'y a pas de perte de rayons entre la préparation et l'objectif, on augmente aussi l'angle
du cône lumineux : sin u augmente donc e diminue.1.1.2. Les autres microscopes photoniques
L'observation d'échantillons biologiques en microscopie photonique par transmission nécessite des
étapes de préparation (elles seront décrites en détail dans les prochains paragraphes).Elles ont pour but de rendre l'échantillon :
- mince pour que la lumière puisse le traverser (confection de coupes) ;- et contrasté pour qu'il puisse absorber la lumière davantage que le milieu ambiant (coloration).
Les traitements utilisés ne permettent pas de conserver vivantes les cellules.Ainsi, la possibilité d'une perte ou d'une altération de certains composants cellulaires durant ces
étapes de préparation a toujours préoccupé les microscopistes.La façon la plus convaincante d'établir l'existence d'une structure dans les cellules vivantes est de les
examiner au microscope quand elles sont vivantes. Cela est possible en utilisant d'autres
microscopes. Toutefois l'observation des structures ne sera plus directe mais on obtiendra des informations indirectes sur l'existence de certaines structures. * Le microscope à contraste de phase = microscope à interférence différentielleLe microscope à contraste de phase est équipé d'un système optique, appelé plaques de phase qui
permet d'exploiter les propriétés de diffraction des cellules. Ce système est situé dans la monture de l'objectif.Il permet de faire interférer dans la formation de l'image les rayons réfractés (=ont traversé la
prépa en étant déviés cf. indice de réfraction de cellule différent de celui du milieu ambiant) et les
rayons diffractés qui ont subit un retard de l'l/2.Quand la lumière passe à travers une cellule vivante, si les structures sont peu épaisses l'onde n'est
pas arrêtée (= absorbée) mais la phase de l'onde est modifiée, elle est retardée et changera donc de
phase par rapport à la lumière ayant traversé une région voisine plus mince. Le système optique du microscope à contraste de phase recombine ces deux séries d'onde pour supprimer la lumière traversée en cette zone.Cela contraste la structure qui a créé le retard de phase. En effet, grâce à cette interférence, même si
une structure a un indice de réfraction proche du milieu ambiant elle apparaîtra noire ou grise par
rapport à ce milieu ambiant.L'intérêt de ce microscope = Ce microscope amplifie de faibles différences d'indice de réfraction, il
permet d'observer des cellules vivantes sans coloration donc sans qu'il y ait eu de formationd'artéfacts (= structure artificielle apparue suite aux traitements imposés aux cellules lors de leur
préparation pour l'observation). * Le microscope à fond noirUn façon plus simple de voir les détails d'une cellule non colorée, que l'utilisation du microscope à
contraste de phases, consiste à utiliser la lumière dispersée par les divers constituants cellulaires
(= lumière diffractée).Un dispositif placé sous la platine du microscope permet d'éclairer la préparation biologique en
lumière rasante. Les rayons incidents qui traversent la préparation ne pénètrent pas dans l'objectif, seuls pénètrent dans l'objectif les rayons diffractés.On peut ainsi observer les régions des cellules qui diffractent fortement la lumière. Elles apparaissent
très brillantes sur un fond obscur donné par les régions très peu diffractantes. Il est donc possible de
voir des structures de taille inférieure au pouvoir séparateur du microscope mais sans en discerner la
forme ; on met juste en évidence leur existence ----> donne information indirecte sur les structures.
* Le microscope à lumière polariséeLa source lumineuse est constituée par un faisceau dont les vibrations sont situées toutes dans un
même plan appelé plan de polarisation.En éclairant un échantillon avec de la lumière polarisée, il est possible de mettre en évidence
les régions biréfringentes de la cellule.La biréfringence = propriété que possède une structure de dédoubler un rayon lumineux polarisé en
deux nouveaux rayons, tous deux polarisés suivant des plans de vibration perpendiculaire et sepropageant à la même vitesse. Ces deux rayons sont donc caractérisés par des indices de réfraction
distincts ; la biréfringence représente exactement la différence entre les deux indices.La biréfringence est liée à la présence de structures ou de molécules asymétriques rangées
régulièrement, mais que l'on ne peut pas distinguer avec un microscope à lumière par transmission
puisque leur taille est bien inférieure à son pouvoir séparateur. * Le microscope à rayons UV (= à fluorescence)Le pouvoir séparateur de ce microscope est supérieur à celui du microscope photonique ordinaire
(utilisant la lumière blanche) puisqu'il utilise, pour éclairer la préparation, les rayons UV
caractérisés par une longueur d'onde plus faible.UV usuels = 390 à 200 nm
UV courts = 200 à 100 nm
La distance limite appréciable avec ce microscope peut descendre jusqu'à 0,06 µm (60 nm = 600A
°m).
Dans un microscope à fluorescence les lentilles sont en quartz (cf. le verre s'oppose au passage des
UV).L'observation se fait sur un écran fluorescent où l'image obtenue peut être photographiée.
NB : Le microscope à fluorescence peut aussi exploiter la propriété de fluorescer de certaines
préparations :Fluorescence = propriété d'émettre une lumière de fluorescence qui se caractérise par une
longueur d'onde supérieure à la longueur d'onde de la lumière d'éclairement.- Fluorescence primaire : mise en évidence de constituants naturels ayant la propriété de
fluorescence. C'est surtout le cas pour des préparations botaniques et minéralogiques.- Fluorescence secondaire : c'est une fluorescence artificielle crée par imprégnation des éléments à
observer par des fluorochromes qui ne se fixent que sélectivement sur certains constituants ou qui se
fixent spécifiquement sur des constituants car ils ont été greffés sur des molécules d'anticorps dotées
d'une spécificité de reconnaissance. Ces techniques sont illustrées par les tests immunologiques
d'immunofluorescence que l'on étudiera plus tard. * Le microscope confocal à balayage - observation d'échantillons massifs - marquage = coloration par sondes fluorescentes - source lumineuse = rayon laser - éclairement en un point de la préparation = foyer d'excitation = point focal - déplacement du point focal d'éclairement à l'intérieur de l'échantillon - émission de fluorescence suite à l'éclairement au point observé- seule la fluorescence du point focal est recueillie = focalisation de la lumière d'émission dans le
détecteur = foyer d'émission = point confocal (qui va avec le point focal) - balayage du faisceau lumineux dans le plan = analyse du plan - observation sur plusieurs plans focaux = analyse épaisseur - traitement informatique des images séquentielles - résultat = image en trois dimensions de l'échantillon.1.2. Les microscopes électroniques
1.2.1. Généralités
* Principe : - L'échantillon à observer est bombardé par un flux d'électrons (ë).- Emploi d'ë en mouvement à la place de la lumière. Comme pour la lumière, (= flux de particules
énergétiques = photons en mouvement), les ë se déplacent selon une onde = onde de matière (vue en
physique). La longueur d'onde du flux d'ë dépend de la tension à laquelle sont soumis les ë.
La longueur d'onde d'un ë diminue quand la vitesse de déplacement de l'ë augmente. - La source d'ë est un filament chauffé = cathode.- Le flux d'ë est dévié par des champs magnétiques qui le focalisent comme les lentilles de verre le
font pour la lumière dans le microscope photonique. - L'image est perceptible grâce à un écran fluorescent. - Ces images peuvent être photographiées et sont souvent agrandies ensuite. * Performances :La limite de résolution imposée par la longueur d'onde de la lumière visible peut être abaissée car les
ë en mouvement créent une onde de longueur d'onde plus courte que celle de la lumière. Lalimite de résolution d'un microscope électronique sera donc plus petite et le pouvoir séparateur plus
élevé que celui d'un microscope photonique.
Dans un microscope électronique possédant une tension d'accélération de 100 000 volts, la
longueur d'onde de l'ë est de 0,002 nm c'est à dire 200 000 fois plus petite que la plus petite
longueur d'onde de la lumière (400 nm = 200 000 x 0,002). En théorie la résolution d'un tel microscope devrait être d'environ 0,002 nm.- Toutefois du fait que les aberrations des lentilles électroniques sont considérablement supérieures
aux lentilles de verre, le pouvoir séparateur de la plupart des microscopes électroniques est bien
moins élevé, la limite de résolution est donc nettement supérieure à la longueur d'onde de l'ë en
déplacement (au mieux, elle serait de 0,1 nm).- De plus, les altérations causées lors de la préparation de l'échantillon (coupes, obtention de
contrastes) et les dégâts causés par l'irradiation limitent la résolution des objets biologiques à environ
2 nm. (20 Äm). C'est 100 fois mieux que la résolution du microscope photonique.
(Rappel : avec l'objectif à immersion d'un microscope photonique par transmission on a e = 0,2 µm =
200 nm).
Lorsque les préparations sont observées sous des tensions très élevées, microscope haute tension,
le pouvoir séparateur peut atteindre 5Äm.- Les grossissements obtenus sont très élevés 500 000 fois le diamètre pour 1000 fois en
microscopie photonique. * Inconvénients :- Les ë ne se propagent que dans le vide très poussé ce qui empêche toute observation sur le
vivant ;- La pénétration des ë dans la matière est très faible, donc les coupes doivent être très minces
(de l'ordre de 0,06 à 0,09 µm ~ 0,1 µm pour 2 à 5µm en microscopie photonique) ; * Il existe deux types de microscope électronique. - Le microscope électronique par transmission ; - Le microscope électronique à balayage.1.2.1 Le microscope électronique par transmission
L'objet à observer est placé sur le trajet du faisceau d'ë.Selon la densité locale du matériel, certains ë qui traversent l'échantillon sont déviés, ils ne figurent
pas sur l'image. Les régions denses de l'échantillon se distinguent donc par des zones de flux électronique réduit c'est à dire zones + ou - sombres sur l'image.Les ë qui traversent l'échantillon sont, eux, focalisés pour former une image, soit sur un écran
fluorescent, soit sur une plaque photo.Ce sont donc les ë qui traversent l'échantillon qui contribuent directement à la formation de
l'image. On ne peut qu'observer des objets très minces, généralement on s'adresse à des coupes.
1.2.2. Le microscope électronique à balayage
Les échantillons sont bombardés par un faisceau d'ë, mais seuls sont utilisés pour la formation de
l'image, les ë qui sont réémis par la surface de l'échantillon.A la différence du microscope électronique par transmission, il est donc possible d'étudier des
échantillons massifs dont seule la surface est observée.Pratiquement, la surface de l'objet est balayée par un faisceau très fin d'ë, d'où le nom donné à
l'instrument.Un récepteur recueille les ë réémis par la surface de l'objet et donne un signal qui, après
amplification, module l'intensité d'un faisceau qui balaie un écran de télévision en synchronisme avec
le balayage du faisceau d'ë.L'image obtenue sur l'écran de télévision donne avec une très grande profondeur de champ une vue
tridimensionnelle de la surface de l'échantillon avec une résolution de l'ordre de 250A°m.2. Les conditions d'observation aux microscopes
2.1. Méthodes d'études par microscopie à lumière
2.1.1. Les contraintes et les différentes étapes du traitement des échantillons
* Contraintes :- Epaisseur : Dans l'observation par transmission, qui est la plus employée, les rayons lumineux qui
contribuent à la formation de l'image traversent l'objet. Ainsi, l'observation exige que l'objet soit de
faible épaisseur pour être traversé. De plus, il faut éviter les superpositions des structures pour que
l'image ne soit pas trop confuse. Cette épaisseur ne doit pas dépasser 2 à 5 µm. -----> Comme nous l'avons vu, les dimensions des cellules sont plus grandes, il faut donc recourir aux méthodes de la microtomie = confection de coupes.- Contrastes : L'observation par transmission au microscope photonique, ne fournit des
renseignements que si certaines régions de l'objet absorbent la lumière plus que d'autres, c'est à
dire si cet objet présente des contrastes.Généralement les constituants cellulaires ont très peu de contrastes les uns par rapport aux autres ;
aussi est-on obligé d'employer certains artifices pour augmenter ceux-ci.----> Il est possible d'amplifier les très faibles différences de contrastes qui existent entre les
différentes régions de la cellule en recourant à des montages optiques qui utilisent la nature
ondulatoire de la lumière = cas du microscope à contraste de phase.----> On peut d'autre part, créer artificiellement des contrastes au niveau de certaines structures
cellulaires en réalisant des colorations. On exploite alors des combinaisons entre certains
constituants biochimiques cellulaires et des produits absorbant certaines longueur d'onde de lalumière = colorants. La coloration des préparations biologiques est très largement utilisée.
* Les différentes étapes du traitement :Des coupes de quelques microns d'épaisseur ne peuvent être réalisées que si la dureté de
l'échantillon à couper est convenable. Les cellules ont une consistance visqueuse et sont beaucoup trop molles pour être coupées en tranches minces. Il faut donc les durcir artificiellement pour pouvoir les sectionner. Ceci est réalisable si l'on agit sur le constituant le plus abondant des cellules = l'eau. :----> Ou bien on remplace l'eau par un autre liquide pouvant être durci dans certaines conditions =
méthode d'inclusion ;----> Ou bien on fait passer l'eau de l'état liquide à l'état solide = technique de congélation.
Mais ces méthodes, qui permettent de durcir les cellules altèrent considérablement l'organisation
cellulaire. C'est pourquoi il est nécessaire de consolider au préalable les structures par un ensemble
d'opérations appelées fixation.Lorsque la condition de "fine épaisseur" est remplie, il faut ensuite contraster artificiellement
l'échantillon = c'est l'étape de coloration. Chronologiquement ces différentes étapes s'enchainent ainsi :1) fixation = consolider
2) inclusion = durcir
3) microtomie = couper
4) coloration = contraster
2.1.2. La fixation
Une fixation est un traitement chimique ou physique effectué sur des cellules vivantes et permettant
de pratiquer ultérieurement certaines manipulations avec un minimum de dommages pour lesstructures cellulaires. En général la fixation entraine la mort des cellules, ce qui indique que la cellule
a subi des perturbations, dont il conviendra de connaitre la nature et l'importance pour juger de la valeur de la fixation. * Fixation par traitement chimique :La fixation par traitement chimique est réalisée en plaçant les cellules dans liquides que l'on appelle
fixateurs. On classe les fixateurs en deux groupes selon leur action sur les protéines : - fixateurs coagulants, comme l'éthanol (CH3CH2OH), l'acide acétique (CH3COOH) dilué, les solutions aqueuses d'acide picrique (trinitrophénol) ou de chlorure mercureux (HgCl2) ; - fixateurs non coagulants comme les solutions aqueuses de tétroxyde d'osmium OsO4, oud'aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde, etc.). Les protéines étant, après l'eau, le constituant le
plus abondant des cellules, ce dernier type de fixation est évidemment celui qui altère le moins les
structures cellulaires. Il n'est pas difficile de concevoir que le mécanisme de la coagulation consolide les structures cellulaires. Par contre, on connait peu de choses sur le mécanisme d'action des fixateurs non coagulants. Onpense qu'ils créent des ponts entre les molécules voisines. Ainsi le tétroxyde d'osmium peut réagir
avec les doubles liaisons éthyléniques de molécules voisines selon le schéma suivant :Schéma écrit au tableau pendant le
coursLes aldéhydes, comme la formaldéhyde ou la glutaraldéhyde, après avoir formé des composés
d'addition avec les groupements -NH2 de molécules voisines, réalisent des ponts liant les molécules
entre elles. Avec la formaldéhyde, par ex, le schéma de la réaction est le suivant :Schéma écrit au tableau pendant le
coursDes ponts méthylénique entres chaines voisines peuvent également se créer au niveau de liaisons
peptidiques :Schéma écrit au tableau pendant le
coursDans la pratique :
On utilise des solutions aqueuses du fixateur (tétroxyde d'osmium à 1 ou 2 %, formaldéhyde ou
glutaraldéhyde à 2 ou 5 %) tamponnées à un pH voisin de la neutralité. La durée de la fixation
dépend de la taille de l'échantillon à fixer, de la vitesse de pénétration du fixateur dans les cellules, de
la nature des cellules elles-mêmes. Pour des pièces cubiques de quelques millimètres de côté, le
temps de fixation varie, selon le fixateur, de 30 minutes à plusieurs jours. Pour des cellules isolées,
ces temps sont plus courts (de quelques minutes à une demi-heure). * Fixation par traitement physique : Le traitement physique le plus couramment utilisé pour la fixation est la congélation.La pièce à fixer est refroidie rapidement, soit par immersion dans un liquide à basse température
(azote liquide -196°C), soit par détente à son niveau de gaz carbonique comprimé (-60°C). La
congélation doit être rapide pour que les cristaux de glace qui vont se former ne soient pas trop gros,
sinon ils risqueraient de déchirer les structures cellulaires. * Comparaison des performances : Les fixateurs coagulants conservent très mal les organites cytoplasmiques. Ils sont utiliséscependant en histologie lorsqu'il s'agit d'étudier des groupements cellulaires = tissus, sans chercher à
mettre en évidence des détails de structure propre à chaque cellule. En cytologie, les fixateurs chimiques non coagulants donnent des résultats satisfaisants.La meilleure technique reste cependant la congélation. En effet après congélation, certaines
cellules, remises dans des conditions normales de température, reprennent leur activité, donnant ainsi
la preuve que leurs structures n'ont pas été perturbées au point d'entrainer leur mort.2.1.3. Durcissement de l'échantillon et obtention de coupes
* Durcissement par inclusion :Il est obtenu en remplaçant l'eau des cellules par de la paraffine chaude qui durcit en
refroidissant.Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible, ces deux liquides n'étant pas
miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène
qui peut se mélanger à la paraffine liquide (chaude). Cette paraffine remplit dans les cellules les
espaces préalablement occupés par l'eau. En refroidissant, la paraffine se solidifie et donne aux
cellules une consistance qui permet de les débiter en coupes minces. * Durcissement par congélation :Il peut être effectué en même temps que la fixation par la même technique, ou bien en congelant des
cellules déjà fixées par un traitement chimique. * Comparaison des performances : Le durcissement par inclusion entraine des modifications des structures puisqu'on remplace l'eau par des liquides polaires (éthanol et toluène) qui provoquent des extractions et en particulier la dissolution des lipides. Ce n'est pas le cas quand le durcissement est obtenu par congélation. * Obtention de coupes :Les blocs de paraffine ou les blocs de glace contenant les cellules congelées, sont coupés en tranches
à l'aide d'appareils appelés microtomes.
Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le microtome est équipées d'une enceinte
maintenue à -20°C.Dans les deux cas, inclusion à la paraffine ou congélation, la lame servant à trancher est un rasoir
d'acier.quotesdbs_dbs23.pdfusesText_29