fromages du début d'après-midi, à Jérémy mon partenaire de galère toujours présent, ainsi Figure 29 : Principe de fonctionnement d'un cytomètre en flux product, Interchim, Montluçon, France) according to manufacturer's instructions
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UNIVERSITÉ DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES TECHNOLOGIE SANTE (547)THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSIT DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
Discipline : SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
Spécialité : IMMUNOLOGIE
Présentée et soutenue publiquement par
ALEXANDRE PIERRE
Le 11 décembre 2017
ROLE DU VIEILLISSEMENT ET DES PEPTIDES D'ELASTINE SUR LA REPONSE INFLAMMATOIRE ET IMMUNITAIRE AU COURS DE LA BRONCHO-PNEUMOPATHIECHRONIQUE OBSTRUCTIVE (BPCO)
Thèse dirigée par RICHARD LE NAOUR
JURYM. Philippe BILLIALD, Professeur des Universités, Université Paris-Sud, Rapporteur, Président du jury
M. Stéphane BIRKLE, Professeur des Universités, Université de Nantes, Rapporteur Mme Jeanne MOREAU, Maître de Conférences, Université de Limoges, ExaminateurM. Valerian DORMOY, Maître de Conférences, Université de Reims Champagne-Ardenne, Examinateur
M. Richard LE NAOUR, Professeur des Universités, Université de Reims Champagne-Ardenne, Directeur de thèse
Remerciements
Je tiens tout d'abord à remercier le Pr Philippe Billiald ainsi que le Pr Stéphane Birkléd'avoir accepté d'être les rapporteurs de ce travail de thèse, ainsi que le Dr Valérian Dormoy
et le Dr Jeanne Moreau d'avoir également accepté de juger ce travail . Je remercie le Pr Richard Le Naour de m'avoir accepté comme étudiant en thèse, etaccueilli au sein de son laboratoire, l'unité EA4683, en me fournissant tous les moyens
nécessaires afin de mener à bien ce travail de thèse. Vous avez su être présent eu le plus besoin, particulièrement dans les derniers moments de la rédaction du manuscrit etde la préparation de mon exposé final, et je vous en remercie infiniment. J'ai été très heureux
d'avoir travaillé sous votre direction. Merci au Dr Aïda Meghraoui-Kheddar et au Dr Mehdi Sellami de m'avoir montré toutes les techniques qu'ils ont eux-même mises au point et sur lesquelles je me suis appuyé, ainsi qu'au Dr Sandra Audonnet du plateau technique URCACyt pour son expertise en cytométrie en flux. Merci à Flora qui des odeurs de pizza 4 -midi, à Jérémy mon partenaire de galère toujours présent, ainsi la journée. Et enfin, merci à ma famille, à mes parents, et à Amandine qui occupe la place la plus importante dans ma vie. Je vous aime.Table des matières
1Table des matières
Table des matières ........................................................................................... 1
Liste des figures ................................................................................................ 4
Liste des tableaux ............................................................................................. 6
Liste des abréviations ....................................................................................... 7
Contexte Scientifique & Présentation du manuscrit ....................................... 11 INTRODUCTION ......................................................................... 151. La réponse immunitaire ............................................................................. 16
1.1 Le système immunitaire inné ............................................................................ 16
1.1.1 La reconnaissance des pathogènes ....................................................................... 16
1.1.2 Les composants de l'immunitĠ innĠe .................................................................... 17
1.1.2.1 Les cellules épithéliales ......................................................................... 17
1.1.2.2 Les neutrophiles et les monocytes/macrophages ................................. 18
1.1.2.3 Les autres composants ......................................................................... 19
1.1.3 Transition vers le système immunitaire adaptatif................................................. 21
1.2 Le système immunitaire adaptatif .................................................................... 22
1.2.1 Les diffĠrents types d'immunitĠ adaptatiǀe ......................................................... 23
1.2.1.1 L'immunitĠ ă mĠdiation humorale ....................................................... 23
1.2.1.2 L'immunitĠ ă mĠdiation cellulaire ........................................................ 24
1.2.2 Les cellules T dans l'immunitĠ cellulaire ............................................................... 25
1.2.2.1 Reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T .......................... 26
1.2.2.2 La maturation des lymphocytes T ......................................................... 32
1.2.2.3 Les phases de la réponse des lymphocytes T ........................................ 37
1.2.2.4 L'activation des lymphocytes T ............................................................. 39
1.2.2.5 Les sous-populations de lymphocytes T CD4+ ....................................... 41
2. La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive .................................... 46
2.1 Epidémiologie ................................................................................................... 46
2.2 Définitions clinique et fonctionnelle ................................................................. 47
2.3 Physiopathologie de la BPCO ............................................................................ 48
2.3.1 BPCO et immunité innée ....................................................................................... 49
Table des matières
22.3.1.1 Les cellules épithéliales ......................................................................... 49
2.3.1.2 Les macrophages alvéolaires ................................................................ 49
2.3.1.3 Les polynucléaires neutrophiles ............................................................ 51
2.3.2 BPCO et immunité adaptative ............................................................................... 54
2.3.2.1 Lymphocytes T CD8+ ............................................................................. 54
2.3.2.1 Lymphocytes T CD4+ ............................................................................. 56
2.4 BPCO et phases d'edžacerbations ...................................................................... 57
2.4.1 Exacerbations infectieuses .................................................................................... 58
2.4.2 Exacerbations non infectieuses ............................................................................. 58
2.5 Genèse de la BPCO ............................................................................................ 59
3. Elastine et peptides d'Ġlastine (PE) ............................................................ 61
3.1 La matrice extracellulaire ................................................................................. 61
3.2 Les fibres élastiques .......................................................................................... 61
3.2.1 Généralités ............................................................................................................ 61
3.2.2 La biosynthğse de l'Ġlastine .................................................................................. 62
3.3 Les peptides d'Ġlastine (PE) .............................................................................. 64
3.3.1 Les "Matrikines" .................................................................................................... 64
3.3.2 La genğse des peptides d'Ġlastine ......................................................................... 64
3.3.3 Le compledže rĠcepteur de l'Ġlastine (CRE) ............................................................ 65
3.3.4 Propriétés biologiques des PE ............................................................................... 67
3.3.4.1 Propriétés pro-angiogénique et pro-tumorale ...................................... 68
3.3.4.2 Régulation de la réponse inflammatoire .............................................. 68
3.3.4.3 Polarisation de la réponse T ................................................................. 69
3.4 Peptides d'Ġlastine et BPCO .............................................................................. 70
4. Le vieillissement cellulaire .......................................................................... 72
4.1 Généralités ........................................................................................................ 72
4.2 La sénescence cellulaire .................................................................................... 73
4.3 Vieillissement et fonctions pulmonaires ........................................................... 74
4.4 Elastine et vieillissement ................................................................................... 75
4.5 Immunosénescence et inflammaging ............................................................... 75
4.5.1 DĠfinition de l'immunosĠnescence ....................................................................... 75
4.5.2 Le concept d'ΗinflammagingΗ ................................................................................ 76
4.5.3 Immunosénescence et système immunitaire inné ............................................... 77
4.5.4 Immunosénescence et système immunitaire adaptatif ........................................ 79
4.5.4.1 RĠsistance ă l'apoptose ........................................................................ 79
Table des matières
34.5.4.2 Perte du corécepteur CD28 ................................................................... 79
4.5.4.3 Diminution de la fréquence des cellules T naïves .................................. 81
4.6 BPCO et Vieillissement ...................................................................................... 81
BUT DU TRAVAIL ....................................................................... 84 MATERIELS & METHODES ........................................................... 861. Rappels de cytométrie en flux ........................................................................... 87
2. Description du cytomètre en flux utilisé ........................................................... 89
3. Construction des panels multicouleur et stratégies de "gating" ...................... 92
3.1. Principes généraux ................................................................................................ 92
3.2. Panels de vérification des trix cellulaires .............................................................. 93
3.2.1. Tri des lymphocytes T CD4+ ........................................................................... 93
3.2.2. Tri des leucocytes CD45+ ................................................................................ 94
3.2.3. Phénotypage des LBA .................................................................................... 95
3.2.4. Phénotypage des cellules CD45+, CD4+ et CD8+ après stimulation ................ 96
4. Dosage multiplexe par la technique de CBA ................................................... 100
4.1. Principe................................................................................................................ 100
4.2. Etapes de marquage ............................................................................................ 101
4.3. Analyse des résultats ........................................................................................... 102
RESULTATS ............................................................................ 105 Elastin receptor (S-gal) occupancy by elastin peptides modulates T cell response duringmurine emphysema .................................................................................................... 106
Impact of aging on inflammatory and immune responses during elastine-peptide-inducedmurine emphysema .................................................................................................... 146
DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................. 189 BIBLIOGRAPHIE ....................................................................... 195Liste des figures
4Liste des figures
Figure 1 : Les différents PAMP et leurs PRRs correspondants ................................................. 17
Figure 2 : Les différents Toll-like Receptors associés à leurs ligands ....................................... 18
Figure 3 ͗ L'immunitĠ ă mĠdiation humorale ........................................................................... 24
Figure 4 ͗ L'immunitĠ ă mĠdiation cellulaire ............................................................................ 25
Figure 5 : Les molécules de classe I et de classe II du CMH ..................................................... 27
Figure 6 : Le complexe TCR/CD3 .............................................................................................. 28
Figure 7 : Les molécules CD4 et CD8 ........................................................................................ 29
Figure 8 : Interactions entre TCR et CMH à la surface des cellules T CD4+ et T CD8+ .............. 30
Figure 9 : La synapse immunologique ..................................................................................... 32
Figure 10 : Maturation des thymocytes au sein du thymus .................................................... 33
Figure 11 : Les sélections positive et négative des thymocytes .............................................. 35
Figure 12 ͗ Les mĠcanismes d'apprġtement des antigğnes ..................................................... 39
Figure 13 : Les différentes sous-populations de lymphocytes Th ............................................ 42
Figure 14 : La différenciation des cellules Th naïves en Th1 ou Th2 ........................................ 43
Figure 16 : Plasticité des différentes sous-populations de lymphocytes T CD8+ .................... 45
Figure 17 : Obstruction centro-lobulaire et emphysème au cours de la BPCO ....................... 48
Figure 18 : Le rôle central des macrophages alvéolaires au cours de la BPCO ........................ 50
Figure 19 : Le rôle délétère des polynucléaires neutrophiles au cours de la BPCO ................ 52
Figure 20 : Orientation Th1 et Tc1 au cours de la BPCO .......................................................... 55
Figure 21 ͗ Action de l'Elastase dans le poumon ..................................................................... 59
Figure 22 ͗ Peptides d'Ġlastine et BPCO ................................................................................... 60
Figure 23 ͗ Processus de rĠticulation de l'Elastine ................................................................... 63
Figure 25 : Epissage alternatif de la ɴ-galactosidase ............................................................... 66
Figure 26 : Les séquences VGVAPG au sein de la Tropoélastine humaine .............................. 67
Figure 27 : PE et polarisation de la réponse T .......................................................................... 69
Liste des figures
5Figure 28 : Les principaux facteurs du vieillissement physiologique. ...................................... 73
Figure 29 ͗ Principe de fonctionnement d'un cytomğtre en fludž ............................................. 87
Figure 30 : Les différents filtres utilisés en cytométrie en flux ................................................ 88
Figure 31 : Configuration du BD LSR-Fortessa.......................................................................... 91
Figure 32 ͗ Edžemple de fluorochromes ayant une longueur d'onde d'Ġmission semblable,Figure 33 : Stratégie de "gating" pour la vérification du tri des lymphocytes T CD4+ ............. 94
Figure 34 : Expression du CD45 sur un broyat de poumon avant et après tri ......................... 95
Figure 35 : Stratégie de "gating" pour le phénotypage des LBA .............................................. 96
Figure 36 : Stratégie de "gating" pour le phénotypage des CD45+ stimulĠs et l'analyse descytokines intra-cellulaires des cellules Th ......................................................................... 98
Figure 37 : Stratégie de "gating" pour le phénotypage des CD45+ stimulĠs et l'analyse desfacteurs de transcription ................................................................................................... 98
Figure 38 : Stratégie de "gating" pour le phénotypage des lymphocytes T CD4+ stimulés etl'analyse des cytokines ...................................................................................................... 99
Figure 39 : Stratégie de "gating" pour le phĠnotypage des LT CD4н stimulĠs et l'analyse des
facteurs de transcription ................................................................................................. 100
Figure 40 : Différentes étapes de la technique CBA (Flex Set, BD biosciences) .................... 101
Figure 41 : Identification des populations de billes spécifiques des cytokines à desconcentrations différentes .............................................................................................. 102
Figure 42 ͗ Courbes d'Ġtalonnage des cytokines ................................................................... 103
6Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau 1 : Les 13 paramètres de couleurs du BD LSR-Fortessa ............................................. 90
Tableau 2 : Classement des fluorochromes en fonction de leur intensité de fluorescence ... 92Tableau 3 ͗ Panel utilisĠ pour ǀĠrifier l'efficacitĠ du tri des lymphocytes T CD4+ ................... 93
Tableau 4 : Panel utilisé pour le phénotypage des LBA ........................................................... 96
Tableau 5 : Panels utilisés pour le phénotypage des Leucocytes et des LT CD4+ .................... 97
7Liste des abréviations
Liste des abréviations
µL : microlitre
Ac : Anticorps
Acm : Anticorps monoclonal
AIRE : Auto-Immune-Regulator-Element
Akt : protéine kinase B
AMPc : Adénosine Monophosphate cyclique
ARNm : Acide Ribonucléique messager
BCR : Récepteur des Cellules B
BPCO : Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive
BSF-1 : B cell Stimulatory Factor 1
CCL- : CC chemokine Ligand
CD : Cluster de Différenciation
CDR : Complementary Determining Region
CMV : Cytomegalovirus
CRF : Capacité Résiduelle Fonctionnelle
CTGF : Connective Tissue Growth Factor
CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4CXCL- : C-X-C motif chemokine
DC : Cellules Dendritiques
DN : thymocytes Doubles Négatifs
8Liste des abréviations
DP : thymocytes Doubles Positifs
EBP : Elastin Binding Protein
EGF : Epidermal Growth Factor
FcR : récepteurs des parties constantes des immunoglobulinesFEV1 : Forced Expiratory Volume per second
FGF : Fibroblast Growth Factor
fMLP : N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanineFoxP3 : Forkhead box P3
FVC : Forced Vital Capacity
Fyn : Proto-oncogene tyrosine-protein kinase
GATA3 : Trans-acting T-cell-specific transcription factorGMPc : Guanosine Monophosphate cyclique
GOLD : Global Initiative for chronic Obstructive Lung DiseaseHIF-1Į : Hypoxia Inducible Factor 1Į
hsp70 : Heat Shock Protein 70ICAM- : InterCellular Adhesion Molecule
IFN-(Į,ȕ,Ȗ) : Interféron Į,ȕ,ȖIg : Immunoglobuline
IL- : Interleukine -
IMC : Indice de Masse Corporelle
IP-10 : Interferon-inducible protein 10 (équivaut à CXCL10) ITAM : Immunoreceptor Tyrosine based Activation Motif kDa : kilodaltonKO : Knock Out
LBA : Lavages Broncho-Alvéolaires
Lck : lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
9Liste des abréviations
LFA-1 : Lymphocyte function-associated antigen 1
LPS : Lipopolysaccharide
LTB4 : Leucotriène B4
MEC : Matrice Extra-cellulaire
MIG : monokine induced by interferon Ȗ
miRNA : micro acides ribonucléiques mL : millilitre mLN : mediastinal Lymph NodesMMP- : Matrix Metalloproteinase
MT1-MMP : membrane type-1 matrix metalloproteinase mTOR : mechanistic Target Of Rapamycin NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphateNE : Neutrophil Elastase
Neu-1 : Neuraminidase 1
NF-țB : Nuclear Factor-kappa B
NK : Natural Killer
NKT : Lymphocyte T Natural Killer
NLRP3 : NOD-Like Receptor family 3
nm : nanomètre Nrf2 : Trans-acting T-cell-specific transcription factorOH : hydroxyde
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PAMP : Pathogen-Associated Molecular Patterns
PDGF : Platelet-derived growth factor
PI3K : phosphoinositide 3-kinase
10Liste des abréviations
PMN : Polymorphonucléaire Neutrophile
PMT : Photomultiplicateurs
PPCA : Protective Protein Cathepsin A
PPE : Pancratice Porcine Elastase
PRR : Pattern Recognition Receptor
ROR-ȖT : RAR-related orphan receptor gamma
ROS : Reactive Oxygen Species
SASP : Senescence-Associated Secretory Phenotype
SA-ȕ-gal : Senescence-Associated ȕ-galactosidaseS-Gal : Spliced-Galactosidase
SP : thymocytes Simples Positifs
Src : Proto-oncogene tyrosine-protein kinase
T-bet : T-box transcription factor
TCR : Récepteur des Cellules T
TEMRA : T Effector Memory cell CD45RA+
TfH : Lymphocyte T Folliculaire
TGF-ȕ : Tumor Growth Factor ȕ
Th : Lymphocyte T helper
TIMP-2 : Tissue Inhibitor of Metalloproteinases
TLR : Toll-like Receptor
TNF-Į : Tumor Necrosis Factor Į
Treg : Lymphocyte T régulateur
VEMS : Volume Expiratoire Maximal par Seconde
VRS : Virus Respiratoire Syncitial
Contexte scientifique & présentation du manuscrit 11Contexte Scientifique &
Présentation du manuscrit
La réponse
pour se protéger des agressions. Toutefois, cette arme peut se révéler à double tranchant car
elle peut devenir délétère lorsque cette réponse perdure et/ou conduit à des dégradations
complémentaires, la réponse innée avec son processus inflammatoire non spécifique, et la teurs cependant une action plus focalisée au niveau des muqueuses et des barrières biologiques quiérieur.
cigarette qui contient plusieurs centaines de composants chimiques plus ou moins irritants. Leéchappement aux mécanismes de
Obstructive (BPCO).
La BPCO est une affectio
inflammatoire chronique accrue au niveau des voies aériennes et du parenchyme pulmonaire,et caractérisée par une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires. Ainsi,
les mécanismes de défense et de réparation tissulaire sont perturbés, ce qui génère, dans les
Contexte scientifique & présentation du manuscrit 12niveau pulmonaire. Ce déséquilibre, qui représente une des hypothèses étiologiques de la
matrice extracellulaire (MEC), et en particulier des fibres élastiques qui assurent le maintien nombre élevé de lymphocytes T "helper" (Th) et de lymphocytes T cytotoxiques (Tc) est retrouvé dans les voies respiratoires et le parenchyme pulmonaire, et cette augmentation est gravation de la maladie. protéases/anti- poumons de patients atteints de BPCO, il semble que le vieillissement soit également unque par la maladie elle-même, suggérant que ces différents phénomènes partagent des
T CD4+ et T CD8+
du système immunitaire, tant au niveau cellulaire que systémique, causées par le sensibles à ce mécanisme de vieillissement sont les lymphocytes T. Les multiples stimulationsantigéniques qui surviennent tout au long de la vie activent les lymphocytes T qui se
différencient en cellules effectrices et prolifèrent (expansion clonale). Cette prolifération
engendre de nombreux clones qui sécrètent des enzymes, des cytokines pro-inflammatoires et des enzymes cytotoxiques qui permettent de se débarrasser des micro-organismes pathogènes.A la suite de réactivations répétées par le même antigène, les cellules T clonales mémoires
deviennent à chaque fois plraccourcissement inéluctable de leurs télomères engendrant un vieillissement cellulaire
irréversible. Par ailleurs, la multiplication de ces clones mémoires associée à une taille limitée
et invariable de agents pathogènes : le système immunitaire devient par conséquent moins efficace. Contexte scientifique & présentation du manuscrit 13 La diminution de la veille immunologique par les cellules T, causée par les modifications immunologiques liées à la sénescence, a pour conséquence la mise en place agressives e-inflammatoires et de protéases dans les tissus, et notamment dans les muqueuses (dont la muqueuse respiratoire). Ceci génèrealors une inflammation chronique liée à l'âge, appelée "inflammaging", qui peut être à
inflammatoires comme la BPCO.protéases à activité élastinolytique produites par les cellules inflammatoires (polynucléaires
les différents liquides biologiques des patients atteints de BPCO. Par ailleurs, le niveau dequotesdbs_dbs17.pdfusesText_23