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IV Etude cinétique de la libération du produit 1) Gamme étalon n°1 : Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à 410 nm, longueur d’onde à laquelle le produit (PNP) absorbe Nous traçons, ensuite, la droite étalon : DO corrigée = f (quantité de PNP) CF tableau 1 et figure 1a
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En cinétique: Do= ε C l C= Do 1/ε 1/l Activité enzymatique en UI/l= ΔDo/Δt 1/ε 1/l Vt/Ve 10 6 Δt:temps de mesure en min ε: coefficient d’absorption molaire l: trajet optique Vt: volume du mélange réactionnel total ou se fait la mesure Ve : volume du milieu contenant l’enzyme à doser
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Etude expérimentale de
la phosphatase alcaline Enzymologie 2Cabaret Laurine
Martin Laetitia
Groupe C2
01/10/2010
I. Introduction
Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d'une enzyme aifind'étudier l'inlfluence de la concentration en substrat et de la présence d'un inhibiteur sur la
vitesse de réaction. Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline de veau. Il s'agit d'une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d'hydrolyser les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante :R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2-
II. Principe
Aifin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotométrique
des produits apparus dans le milieu, lorsque l'enzyme est en présence de son substrat. Pour faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP) qui, après action de l'enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP) directement dosable à 410nm. + H2O HPO42- +PNPP incolore PNP coloré
Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l'absorbance d'une substancecolorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d'enregistrement
(ordinateur), qui nous permet de visualiser l'évolution de l'absorbance dans un intervalle detemps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâce à la
pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (ΔDO/min). De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gamme étalon de tubes contenant diffférente concentration (connues) de produit. On trace la droite DO = f ([PNP]). En reportant l'absorbance d'une solution de concentration inconnue, on peut en déduire sa concentration.III. Manipulations préliminaires
Aifin de réaliser la gamme étalon et les milieux d'incubation, nous devons préalablement préparer les solutions de substrats de concentrations diffférentes.1) Solution de PNPP :
Nous voulons préparer 6 tubes de solution de PNPP à 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM,0,167mM, 0,125mM, à partir d'une solution mère de 5mM. Pour cela, nous efffectuons une
dilution en cascade.10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL
5mM 2,5 mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM 0,125mM
[PNPP] (umol /L) 5mM 2,5mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM 0,125mMSolution
mère (mL) 20 10 8 10 10 13,4 5H20 (mL) 0 10 12 10 10 6,6 15
Calcul pour la première dilution :
C1 V1 = C2 V2
V1 = 20mL
Donc V1 = (C2 V2 )/ C1 V = (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL Il faut donc prélever 10mL de la solution mère, et ajouter 10mL d'eau pour la diluer 2 fois.2) Solution de glycérophosphate :
Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphate à2,5mM et 1mM, à partir d'une solution mère à 5mM.
7mL 4mL
5mM 2,5 mM 1mM
[GRO-P] 5mM 2,5mM 1mMSolution mère (mL) 10 7 4
H20 (mL) 0 7 6
Calcul pour la première dilution :
C 1 V1 = C2V2
Vf1 = 10mL
Donc V1 = ( C2 V2)/ C1 V = (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL Il faut donc prélever 7mL de la solution mère et ajouter 7mL d'eau pour la diluer 2 fois. IV. Etude cinétique de la libération du produit1) Gamme étalon n°1 :
Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à 410 nm,longueur d'onde à laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traçons, ensuite, la droite étalon :
DO corrigée = f (quantité de PNP)
CF tableau 1 et ifigure 1a
Calcul de la quantité de produit dans les tubes : n = CVTube 1: n = 0 µmole
Tube 2: n= (0,5.10-3. 0,025.10-3)= 0,0125 µmole (C= 6, 25 µmole/ L) Tube 3: n= (0,5.10-3. 0,05.10-3) = 0,025 µmole (C=12,5 µmole/ L) Tube 4: n= (0,5.10-3. 0,1.10-3) =0,05 µmole (C=25 µmole/ L) Tube 5: n = (0,5.10-3. 0,15.10-3) = 0,075µmole (C=37,5 µmole/ L) Tube 6: n = (0,5.10-3. 0,2.10-3) = 0,1 µmole (C=50 µmole/ L)2) Milieux d'incubation :
Cf tableau 2
Calcul de [PNPP] dans chaque tube (A à G) :
On efffectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 mL dans 3,5 mL de milieu réactionnel, puis on prélève 1,75 mL de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL d'enzyme.Première dilution (milieu A) :
[PNPP] = (C PNPP.VPNPP) / Vtotal [PNPP] = (0,125.0,5) / 3,5 = 17,85 µMDeuxième dilution (cuve A):
[PNPP] = (C PNPP.VPNPP) / Vtotal [PNPP] = (17,85.10-3. 1,75)/2 = 15,6 µM On procède de la même manière pour les autres milieux et on obtient: i [PNPP]B = 20,90 µM i [PNPP]C = 31,25 µM i [PNPP]D = 62,5 µM i [PNPP]E = 124,95 µM i [PNPP]F = 324,71 µM i [PNPP]G= 625,0 µM Calcul de la concentration de l'enzyme dans les milieux réactionnels:Cenz Venz = CtubeVtube
Ctube = (0,1 . 0,25)/ 2 = 0,0125 mg/mL = 12,5 µg/mL Maintenant, nous mesurons les variations de la DO dans chaque milieu d'incubation, au cours du temps (3minutes), à l'aide d'un spectrophotomètre et d'un système d'enregistrement. Nous obtenons différentes droites ΔDO = f (t). La pente de chaque droite,ΔDO/min, représente la vitesse de la réaction, aux temps initiaux, pour une concentration en
substrat donnée.Cf tableau 2 ifigure 2
Commentaire :
D'après les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et de façon linéaire pendant environ 1min. Ce qui signiifie que la quantité de produit dans le milieu augmente. De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A à G), plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse d'apparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat. Ensuite, pour un temps > 1minute, Il n'y a plus de relation linéaire (pour les milieux A, B, C, D, E). En efffet, la quantité de substrat dans le milieu, diminue au fur et à mesure de la réaction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit formé donc l'absorbance n'augmente plus de façon linéaire. Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linéaire. Efffectivement,la quantité de substrat est encore suiÌifiÌisante pour que la réaction s'efffectue à une vitesse
initiale, maximale.Nous voulons déterminer [PNP]/min, c'est-à-dire la vitesse d'apparition du produit à partir
de la pente ΔDO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur la gamme étalon n°1, et on regarde à quelle quantité de produit cela correspond.On obtient :
ΔDO/min 0,0126 0,108 0,2646 0,3762 0,3792 0,4128 0,4295 [PNP]/min µmole/L/min 0,62 5,62 17,2 23,12 23,74 25,0 26,25V. Inlfluence de la concentration en substrat sur
la vitesse de la réaction1) Etude graphique de la vitesse de réaction en fonction de [PNPP] :
Grâce aux vitesses initiales déterminées précédemment, on trace la courbe de Mickaelis-
Menten : Vi = f([PNPP]).
Représentation graphique :
On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km : i Vmax = 0,411 ΔDO/min Si on reporte cette valeur sur la gamme étalon n°1, on trouve Vmax = 24,9 µmole/min i Km = 23,4 µmole/L Ces valeurs ne sont que des estimations, la représentation de Mickaelis-Menten étant une courbe, il y a une importante marge d'erreur lors de la détermination de Vmax.De plus, le Km est lié à la valeur de Vmax, donc la marge d'erreur se rapporte également, à la
valeur du Km.Ainsi, il est nécessaire de linéariser cette représentation, aifin de diminuer ces incertitudes,
et obtenir des valeurs beaucoup plus précises. Nous allons donc utiliser les représentations de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf.2) Détermination de la vitesse maximale et de la constante de Mickaelis :
La cinétique de la réaction suit l'équation de Mickaelis- Menten : la vitesse initiale pour une
certaine concentration en substrat (PNPP) est de la forme : Et d'après cette équation, on peut en déduire la représentation de Lineweaver - Burke :Représentation graphique :
Vi = A partir de la représentation de Lineweaver-Burke, on peut en déduire celle de Hanes-Woolf :
= [PNPP] .Représentation graphique :
Les représentations graphiques de ces deux relations, sont préférables à celle de Mickaelis-
Menten, car elles sont linéaires et donc plus précises pour la détermination des constantes cinétiques Vmax et Km, d'une réaction enzymatique.On obtient donc les résultats suivant :
H Lineweaver-Burke :
- Vmax = - Km =H Hanes-Woolf :
- Vmax = 27,2 µmole/L/min - Km = 34,42 µmole/L Pour la représentation de Hanes-Woolf, nous avons enlevé le premier point de la courbe, car il ne correspondait pas au résultat attendu, il faussait la droite.Cf ifigure 4b et 4b'
3) Ordre de la réaction :
D'après la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de 0 à0,3 µM), on a une courbe linéaire.
H [PNPP] >> Km donc, V = (Vm/Km) . [PNPP]
Or Vm/Km = constante, donc V = K[PNPP]
H La vitesse est proportionnelle à la concentration en substrat dans le milieu, donc la réaction est d'ordre 1. Pour des concentrations en substrats importantes (de 200 à 500 µM), on a un plateau.H [PNPP] << Km donc, V = Vmax
H La réaction est d'ordre 0
4) Détermination de l'activité spéciifique de l'enzyme :
L'activité spéciifique As est la quantité de substrat convertie en produit par unité de temps,
au cours d'une réaction enzymatique. Elle est exprimée en µmole/min. i Activité Enzymatique AE = Vmax . Vcuve i AS Zn2+ = (Vmax . Vcuve) / (menz) AS Zn2+ = (27,2. 0,002) / (0,1 . 0,25) = 2,2 µmol/min/mgOr l'activité spéciifique obtenue en présence de Mg 2+ dans les conditions optimales est cinq
fois plus forte que l'activité spéciifique en présence de Zn 2+.AS Mg2+ = AS Zn2+ . 5 = 2,2 . 5 = 11,0 U/mg
L'activité spéciifique que nous trouvons est légèrement plus élevée que celle donnée par la
fabriquant. VI. Etude d'un phénomène de compétition entre deux substrats1) Gamme étalon n°2
Nous réalisons une deuxième gamme étalon de tube, puis nous mesurons la DO à 410nm.Cf tableau 4 et ifigure 1b
Calcul de la quantité de PNP dans chaque tube : i Tube 1: n= 0 µmol i Tube 2: n= (CPNP . VPNP) = (0,5 . 0,2) = 0,10 µmoleDe la même manière, on obtient :
i Tube 3: n= 0,20 µmole i Tube 4: n= 0,30 µmole i Tube 5: n= 0,40 µmole i Tube 6: n= 0,50 µmole Calcul de la concentration de PNP dans chaque tube : i Tube 1: C= 0 µmol/L i Tube 2: C= (CPNP . VPNP) / Vtot = (0,5 . 0,2) / 5 = 20 µmol/LDe la même façon, on obtient :
i Tube 3: C= 40 µmol/L i Tube 4: C= 60 µmol/L i Tube 5: C= 80 µmol/L i Tube 6: C= 100 µmol/L2) Compétition entre le glycérophosphate et le PNPP
Cf tableau 5
Dans cette partie, nous allons étudier l'inlfluence d'un inhibiteur : le glycérophosphate (GRO-P) sur la
vitesse de la réaction enzymatique. Pour cela, nous allons préparer des séries de tubes deconcentration en inhibiteur et en substrat (PNPP) diffférente. Nous allons ensuite, lancer la réaction
enzymatique dans chaque tube, pendant 3min exactement, aifin de pouvoir comparer les vitesses avec celles obtenues précédemment.Enifin, nous mesurons la DO à 410nm.
Calcul des concentrations en Glycérophosphate dans les tubes :C1V1 = C2V2 H C1 = C2V2/V1
i Série A : C = (0,001 . 0,001)/0,004 = 0,25mM i Série B : C = 0,625mM i Série C : C = 1,25mM Calcul des concentrations en PNPP dans les tubes :C1V1 = C2V2 H C1 = C2V2/V1
i Série 1 : C = (0,0005 . 0,000125)/0,004 = 15,6 µmol/L i Série 2 : C= 20,90 µmol/L i Série 3 : C =31,25 µmol/L i Série 4 : C= 62,5 µmol/L i Série 5 : C= 124,95 µmol/L i Série 6 : C= 312,5 µmol/L i Série 7 : C= 625 µmol/LDétermination de la vitesse de réaction :
Après l'arrêt de la réaction, nous mesurons l'absorbance de chaque tube à 410nm.Aifin de déterminer la quantité de produit libéré (en µmole/L), on reporte les valeurs de la
DO sur la gamme étalon n°2. Pour obtenir la vitesse de la réaction, on divise ces valeurs par
le temps d'incubation (3min). On a alors, une vitesse en µmole/L/min. Cependant, il faut d'abord calculer la concentration de PNP libéré, avant l'ajout de NA2HPO4, qui a permis de stopper la réaction enzymatique. On multiplie alors cette concentration par le coeiÌifiÌicient de dilution d = 5/4. d = volume total/volume sans NA2HPO4CPNP = CPNP (NA2HPO4) . 5/4
CPNP (A1) = 7,5 . 5/4 = 9,4 µmole/L
C'est la valeur de la concentration non diluée, que l'on divise par le temps d'incubation.V(A1) = 9,4/3 = 3,1 µmole/L/min
On procède de la même manière pour les autres essais. Nous traçons, ensuite, les courbes V= f ([PNPP] (ifigure 3) pour chaque concentration de glycérophosphate.Commentaire :
Sur la ifigure 3, on observe que la vitesse de réaction sans inhibiteur est supérieure à celle
avec inhibiteur. Efffectivement, pour une même concentration en substrat (124,9 µmole/L), la vitesse est de 23,74 µmole/L/min sans inhibiteur, alors qu'elle est de 12,5 µmole/L/min avec une concentration en inhibiteur de 0,25mM. Ainsi, on peut dire, que le glycérophosphate diminue la vitesse d'hydrolyse du substrat. De plus, on remarque, que plus la concentration en inhibiteur est importante, plus la vitesse de réaction est faible. On voit que pour la même concentration de substrat que précédemment, la vitesse est de 12,5 µmole/L/min pour une concentration de glycérophosphate de 0,25mM, et de 3,73 µmole/L/min pour une concentration de 1,25mM.Pour conclure, la vitesse de réaction est diminuée par la présence d'inhibiteur, et d'autant
plus que sa concentration est importante.Aifin de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax et Km), on linéarise la représentation de
Mickaelis-Menten, en utilisant l'équation de Lineweaver-Burke (ifigure 4a). [PNPP] Enµmole/L 15,6 20,9 31,3 62,5 124,9 312,5 625
1/[PNPP]
0,064 0,048 0,032 0,016 0,008 0,0032 0,0016
Commentaire :
Sur la ifigure 4a, on peut voir que chaque courbe se coupe en un même point sur l'axe des ordonnées.
On a alors une valeur de (1/Vmax) identique pour chacune. En revanche, la valeur de ( -1/Km) difffère en fonction de la concentration en inhibiteur : Onremarque que plus la concentration en glycérophosphate est grande, plus( -1/Km) est petit donc plus
le Km est grand.Ainsi, l'inhibiteur a une inlfluence sur le Km de la réaction, mais pas sur la Vitesse maximale. On peut
donc en déduire, que le glycérophosphate agit comme un inhibiteur compétitif, c'est-à-dire qu'il
prend la place du substrat naturel de l'enzyme. Celle-ci présente, alors, une plus faible aiÌifiÌinité pour
son substrat (PNPP) : le Km augmente. Schéma réactionnel d'une inhibition compétitive :