TD 4b: PCR - Institut national de la recherche agronomique
Exercice n°7 Hybridation amorce-matrice Choix de la température – Tm: t° où 50 de l’ADN est double brin la PCR quantitative 96 Replicates -1 00E-01 4
Rappel Détermination des conditions (amorces, t°C d
PCR et séquençage: une amorce matrice + dNTP 1 Dénaturation 95-96°C 2 Hybridation 50-55°C 3 Polymérisation 60-70°C Exercice n°33 quantité ADN total
Extraction d’ADN, PCR et séquençage de l’ADN
oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer L’élongation de l’amorce est réalisée par le fragment de Klenow (une ADN polymérase I dépourvue d’activité exonucléase 5’→3’) et maintenue par des ADN polymérases thermostables, celles qui sont utilisées pour la PCR
Concevoir des amorces pour la réalisation d’une PCR Primer 3
Concevoir des amorces pour la réalisation d’une PCR Primer 3 version 0 4 0 Groupe Formation Action – Académies de Besançon, Nancy-Metz, Strasbourg 2011-2014 Développer les usages du numérique dans l’enseignement des biotechnologies au lycée 1/2 Primer 3 permet de proposer des couples d’amorces adaptés à la réalisation d’une PCR
Fiche astuce : déterminer les amorces à utiliser pour
Pour résoudre ce genre d’exercice plus rapidement vérifiez bien que les amorces sont écrites dans le sens 5’ - 3’ Si ce n’est pas le cas, écrivez dans le sens inverse pour avoir l’amorce dans le bon sens A savoir que pour le Pr Couderc la première amorce proposée correspond à l’amorce 1 et la deuxième amorce à l’amorce 2
CORRIGE DU 1er CONTROLE CONTINU - sorbonne-universitefr
Q 7: Des amorces de 20 nucléotides sont utilisées pour cette PCR Donner les séquences des oligonucléotides amorces qui vous permettront d'amplifier ce fragment d'ADN 100-750 par PCR (les nucléotides en gras et soulignés indiquent les bornes du fragment d'ADN désiré) Précisez l'orientation 5'-3' des ces oligonucléotides
Biologie Moleculaire-2013 http://mysitescienceuottawaca
Exercice 6 13 févr Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ Criblage par PCR des transformants Analyse des produits du PCR de colonies Repiquage sur X-Gal Projet III: Empreintes génomiques SEMAINE D’ÉTUDE 17-23 févr Exercice 7 27 fév Projet IV : Contrôle transcriptionnel du gène Mel1
Monitoring CML patients by RQ-PCR - NGRL
of pcr testing Some look at 10,000 cells, some look at 1 million The bigger the sample size, more sensitive is the test There is no universal standard The trick is to go on testing at one particular machine and achieve their zero and mantain it You must ask your doctor what number they consider pcr negative Rgds, Anjana
Examen final BIO1101 – Section à développement
PCR les séquences obtenues afin d’y détecter, ou non, la présence d’un transcrit correspondant à votre séquence d’intérêt Dans cette expérience, vous utilisez les deux amorces suivantes: 5’-ggtggggcaggcgga-3’ 5’-ccctagttgcagtag-3’
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1
TD2: PCR
Rappel
Détermination des conditions (amorces, t°C d'hybridation)RT-PCR
PCR et séquençage
PCR quantitative
Module 9: B. Brunel
Septembre
20072 Le principe de la PCR (rappel) = amplification génique c lonage in vitro
» 100
pb-3 k b max 5 kb (standard), long PCR kits ---> 35 KbKary Mullis, prix nobel 1993
outil incontournable avantages: simple, rapide, très sensible, peu de matériel, peu de purification 3 4Programmation d'un thermocycleur pour PCR:
4 3 2 11. Dénaturation
2. hybridation
3 . polymérisation95°C
d es amorces72°C
Thyb?4. nombre de cycles: 20-40
5Elaboration des
a morcesDétermination
de la taille optimale des amorcesExercice
n°7 A noter: longueur des amorces pour une amplification spécifique Choix des séquences
des amorcesExercice
n°8aSavoir déterminer les amorces sens et antisens
6Détermination
de la T° d'hybridationExercices
n°8bTm: t°
où50% de
l'ADN est double brinFormule empirique
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Température d'hybridation:
= min (Tm1, Tm2) - 4 °C Tm diminue de 1 à 1,5°C par % de différence si une base diffère:1/20 ---> 5%
7Mésappariement
possible, mais pas n 'importe où (5' = 3')Vitesse d'élongation: env. 1,5-4 Kb/min
--->1 Kb/minEviter bases complémentaires entre amorces
et à l'intérieur de l'amorce (struct secondaire)Eviter séquences répétées
T° de fusion proche entre amorces
% GC de 40-60 8Transcriptase inverse
Amplifier
l 'ARN: la RT-PCR 9PCR et séquençage:
une amorce matrice + dNTP1. Dénaturation 95-96°C2. Hybridation 50-55°C3. Polymérisation 60-70°Cn= 25 cycles
---> amplification linéaire 10 structure of a dNTP (déoxynucléotide)
structure of a dd NTP d idéoxynucléotide)
OBASE (A, T, G, C)
HO O P O P O P C O O O O O O O OH O O O OBASE (A, T, G, C)
O P O P O P C O O O O OH 5' 3' 11 C A G T 12 (Polyacrylamide) 13Quantifier l'ADN: la PCR quantitative
96 Replicates
-1.00E-014.00E-019.00E-011.40E+00
1 6 11 16 2126
31
36