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2 oct 2015 · Expression de gènes et marqueurs spécifiques de pluripotence admis que la culture prolongée de cellules pluripotentes ES ou iPS
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1 Ecole doctorale " Des génomes aux organismes » THESE Mention " Biologie Cellulaire et Moléculaire » Par Jennifer ALLOUCHE
Différenciation des cellules souches pluripotentes en mélanocytes et applications potentielles : de la neurofibromatose de type 1 Soutenue le 2 juillet 2015 à Evry devant le jury composé de : Président du jury : Pr. Elisabeth Petit-TeixeiraRapporteur : Dr. Nadège Bondurand
Rapporteur : Pr. Smail Hadj Rabia
Examinateur : Pr. Dominique Vidaud
Examinateur : Dr. Sandrine Bessou Touya
Directeur de Thèse : Dr. Christine Baldeschi
2Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 4
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. 6
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................ 7
RESUME ................................................................................................................................... 8
ABSTRACT .............................................................................................................................. 9
I. LES MELANOCYTES ................................................................................................... 11
LOCALISATION DES MELANOCYTES ................................................................................ 11 A.
1. La structure de la peau .............................................................................................. 11
LES MELANOCYTES ........................................................................................................ 14 B.
1. Origine embryonnaire des mélanocytes : la crête neurale ........................................ 15
2. Détermination du lignage mélanocytaire .................................................................. 21
II. LA PIGMENTATION .................................................................................................... 28
LES MELANOSOMES : LIEU DE SYNTHESE ET DE STOCKAGE DE LA MELANINE ................. 28 A.1. Biogénèse des mélanosomes ...................................................................................... 28
2. La synthèse de la mélanine ........................................................................................ 29
3. Le Trafic des enzymes ................................................................................................ 30
4. Le transport des mélanosomes et le transfert aux kératinocytes ............................... 31
REGULATION DE LA MELANOGENESE ............................................................................. 32 B.
III. LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 .................................................................. 37
GENERALITES ................................................................................................................. 37 A.
PRESENTATION CLINIQUE DE LA NF1 ............................................................................. 37 B.
C. ASPECTS GENETIQUES ET MOLECULAIRES DE LA NF1 .................................................... 41
1. Le gène NF1 ............................................................................................................... 41
2. Le produit de NF1 : La neurofibromine .................................................................... 45
IV. UTILISATION DES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES HUMAINES POUR LA MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NF1 ....................................... 48 OBTENTION DE CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES (CSP) ........................................... 48 A.1. Cellules souches embryonnaires humaines (hESC) .................................................. 48
2. Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSC) ............................................. 54
CARACTERISTIQUE DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES (CSP) .............................. 58 B.1. Maintien de la pluripotence ....................................................................................... 58
2. Contrôle qualité des cellules pluripotentes humaines ............................................... 61
APPLICATIONS POTENTIELLES DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES HUMAINES ...... 63 C.1. La modélisation pathologique et la recherche de médicaments ................................ 63
2. La thérapie cellulaire ................................................................................................ 65
IV. OBJECTIFS .................................................................................................................... 67
3 MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 ........................ 67 A.V. RESULTATS ................................................................................................................... 72
TYPE 1 A PARTIR DE HESC ..................................................................................................... 72
2. Différenciation des hESC-NF1 en une population homogène et proliférative de
mélanocytes ....................................................................................................................... 73
3. Résultats ..................................................................................................................... 74
4. Conclusions et perspectives ....................................................................................... 77
DIFFERENCIATION DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES HUMAINES EN UNE B. POPULATION HOMOGENE ET PROLIFERATIVE DE MELANOCYTES ......................................... 1102. Introduction ............................................................................................................. 112
3. Résultats ................................................................................................................... 113
4. Conclusions et perspectives ..................................................................................... 124
VI. DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES ........................................................................ 128
INTERET DES CSP COMME OUTIL DE MODELISATION .................................................... 128 A.
LA MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 A PARTIR DE B.HESC ................................................................................................................................... 130
dérégulation de la mélanogenèse. ................................................................................... 132
ASSOCIEES A DES TROUBLES PIGMENTAIRES ........................................................................ 138
DEVELOPPEMENT NORMAL ET PATHOLOGIQUE DU MELANOCYTE ......................................... 139 UTILISATION DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES POUR LE CRIBLAGE A HAUT DEBIT E.POUR LA RECHERCHE DE COMPOSES ..................................................................................... 142
UTILISATION DES MELANOCYTES DERIVES DE CSP POUR LA THERAPIE CELLULAIRE F.VII. CONCLUSION GENERALE ...................................................................................... 147
4ACTH: Adrenocorticotropic hormone
AMPc: Cyclic adenosine monophosphate
BMP: Bone morphogenic protein
CCN: Cellules de la crête neurale
CREB: Cyclique AMP response element
DAG: diacylglycerol
DCT: Daupachrome tautomérase
DHI: Dihydroxyindole.
DOPA: Dihydroxyphénylalanine
EDN3: Endothéline 3
FGF: Fibroblast growth factor
IP3: Inositoltriphosphate
JDE: Jonction dermo-épidermique
KIT: Tyrosine protein kinase
L-DOPA: L-3, 4-dihydroxyphénylalanine
MAP: Mitogenic activated protein
MC1-R: Melanocortin recetor type 1
MITF: Microphtalmia associated transcription factorMSH: Melanocyte-stimulating hormone
NF: Neurofibromatose
NF1: Neurofibromatose de type 1
NGF: Nerve growth factor
NO: Nitric oxide
MAPK: Mitogen-activated protein kinase
MCI: Masse cellulaire interne
MC1R: Melanocortin receptor type 1
PG: Prostaglandin
PKA: Protein kinase A
PKC-ȕ: Protein kinase C-ȕ
POMC: Proopiomelanocortin
PMEL17: Melanocyte-specific glycoprotein 17
5ROS: Reactive oxygen species
SCF: Stem cell factor
TNF-Į: Tumor necrosis factor Į
TYRP1: Tyrosinase-related protein 1
TYR: Tyrosinase
UV: Ultra-violet
WNT: Wingless type
6Figure 1 : Coupe histologique (section orthogonale) de la structure de la peau ...................... 11
Figure 4 : Formation du tube neural et de la crête neurale. ...................................................... 16
Figure 5 : Les dérivés de la crête neurale ................................................................................. 17
Figure 6 : Réseau génétique de la crête neurale. ...................................................................... 20
Figure 7 : Différenciation de cellules ES de souris DCT :: LacZ en mélanocytes................... 22
Figure 8 : Diagramme du développement du mélanocyte chez les mammifères.. ................... 24
Figure 9 : Schéma représentant les principales voies et les principaux gènes impliqués dans la
différenciation des mélanocytes au cours du développement embryonnaire. .......................... 27
Figure 10 : Morphologie des mélanosomes par microscopie électronique à transmission. ..... 29
Figure 11 : 6\QPOqVH GHV GHX[ P\SHV GH PpOMQLQH HP UHSUpVHQPMPLRQ GX U{OH GHV SULQŃLSMOHVHQ]\PHVLPSOLTXpHV. ................................................................................................................ 30
1 Ecole doctorale " Des génomes aux organismes » THESE Mention " Biologie Cellulaire et Moléculaire » ParJennifer ALLOUCHE
Différenciation des cellules souches pluripotentes en mélanocytes et applications potentielles : de la neurofibromatose de type 1 Soutenue le 2 juillet 2015 à Evry devant le jury composé de : Président du jury : Pr. Elisabeth Petit-TeixeiraRapporteur : Dr. Nadège Bondurand
Rapporteur : Pr. Smail Hadj Rabia
Examinateur : Pr. Dominique Vidaud
Examinateur : Dr. Sandrine Bessou Touya
Directeur de Thèse : Dr. Christine Baldeschi
2Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... 4
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. 6
LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................ 7
RESUME ................................................................................................................................... 8
ABSTRACT .............................................................................................................................. 9
I. LES MELANOCYTES ................................................................................................... 11
LOCALISATION DES MELANOCYTES ................................................................................ 11 A.
1. La structure de la peau .............................................................................................. 11
LES MELANOCYTES ........................................................................................................ 14 B.
1. Origine embryonnaire des mélanocytes : la crête neurale ........................................ 15
2. Détermination du lignage mélanocytaire .................................................................. 21
II. LA PIGMENTATION .................................................................................................... 28
LES MELANOSOMES : LIEU DE SYNTHESE ET DE STOCKAGE DE LA MELANINE ................. 28 A.1. Biogénèse des mélanosomes ...................................................................................... 28
2. La synthèse de la mélanine ........................................................................................ 29
3. Le Trafic des enzymes ................................................................................................ 30
4. Le transport des mélanosomes et le transfert aux kératinocytes ............................... 31
REGULATION DE LA MELANOGENESE ............................................................................. 32 B.
III. LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 .................................................................. 37
GENERALITES ................................................................................................................. 37 A.
PRESENTATION CLINIQUE DE LA NF1 ............................................................................. 37 B.
C. ASPECTS GENETIQUES ET MOLECULAIRES DE LA NF1 .................................................... 41
1. Le gène NF1 ............................................................................................................... 41
2. Le produit de NF1 : La neurofibromine .................................................................... 45
IV. UTILISATION DES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES HUMAINES POUR LA MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NF1 ....................................... 48 OBTENTION DE CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES (CSP) ........................................... 48 A.1. Cellules souches embryonnaires humaines (hESC) .................................................. 48
2. Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSC) ............................................. 54
CARACTERISTIQUE DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES (CSP) .............................. 58 B.1. Maintien de la pluripotence ....................................................................................... 58
2. Contrôle qualité des cellules pluripotentes humaines ............................................... 61
APPLICATIONS POTENTIELLES DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES HUMAINES ...... 63 C.1. La modélisation pathologique et la recherche de médicaments ................................ 63
2. La thérapie cellulaire ................................................................................................ 65
IV. OBJECTIFS .................................................................................................................... 67
3 MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 ........................ 67 A.V. RESULTATS ................................................................................................................... 72
TYPE 1 A PARTIR DE HESC ..................................................................................................... 72
2. Différenciation des hESC-NF1 en une population homogène et proliférative de
mélanocytes ....................................................................................................................... 73
3. Résultats ..................................................................................................................... 74
4. Conclusions et perspectives ....................................................................................... 77
DIFFERENCIATION DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES HUMAINES EN UNE B. POPULATION HOMOGENE ET PROLIFERATIVE DE MELANOCYTES ......................................... 1102. Introduction ............................................................................................................. 112
3. Résultats ................................................................................................................... 113
4. Conclusions et perspectives ..................................................................................... 124
VI. DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES ........................................................................ 128
INTERET DES CSP COMME OUTIL DE MODELISATION .................................................... 128 A.
LA MODELISATION PATHOLOGIQUE DE LA NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 A PARTIR DE B.HESC ................................................................................................................................... 130
dérégulation de la mélanogenèse. ................................................................................... 132
ASSOCIEES A DES TROUBLES PIGMENTAIRES ........................................................................ 138
DEVELOPPEMENT NORMAL ET PATHOLOGIQUE DU MELANOCYTE ......................................... 139 UTILISATION DES CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES POUR LE CRIBLAGE A HAUT DEBIT E.POUR LA RECHERCHE DE COMPOSES ..................................................................................... 142
UTILISATION DES MELANOCYTES DERIVES DE CSP POUR LA THERAPIE CELLULAIRE F.VII. CONCLUSION GENERALE ...................................................................................... 147
4ACTH: Adrenocorticotropic hormone
AMPc: Cyclic adenosine monophosphate
BMP: Bone morphogenic protein
CCN: Cellules de la crête neurale
CREB: Cyclique AMP response element
DAG: diacylglycerol
DCT: Daupachrome tautomérase
DHI: Dihydroxyindole.
DOPA: Dihydroxyphénylalanine
EDN3: Endothéline 3
FGF: Fibroblast growth factor
IP3: Inositoltriphosphate
JDE: Jonction dermo-épidermique
KIT: Tyrosine protein kinase
L-DOPA: L-3, 4-dihydroxyphénylalanine
MAP: Mitogenic activated protein
MC1-R: Melanocortin recetor type 1
MITF: Microphtalmia associated transcription factorMSH: Melanocyte-stimulating hormone
NF: Neurofibromatose
NF1: Neurofibromatose de type 1
NGF: Nerve growth factor
NO: Nitric oxide
MAPK: Mitogen-activated protein kinase
MCI: Masse cellulaire interne
MC1R: Melanocortin receptor type 1
PG: Prostaglandin
PKA: Protein kinase A
PKC-ȕ: Protein kinase C-ȕ
POMC: Proopiomelanocortin
PMEL17: Melanocyte-specific glycoprotein 17
5ROS: Reactive oxygen species
SCF: Stem cell factor
TNF-Į: Tumor necrosis factor Į
TYRP1: Tyrosinase-related protein 1
TYR: Tyrosinase
UV: Ultra-violet
WNT: Wingless type
6Figure 1 : Coupe histologique (section orthogonale) de la structure de la peau ...................... 11
Figure 4 : Formation du tube neural et de la crête neurale. ...................................................... 16
Figure 5 : Les dérivés de la crête neurale ................................................................................. 17
Figure 6 : Réseau génétique de la crête neurale. ...................................................................... 20
Figure 7 : Différenciation de cellules ES de souris DCT :: LacZ en mélanocytes................... 22
Figure 8 : Diagramme du développement du mélanocyte chez les mammifères.. ................... 24
Figure 9 : Schéma représentant les principales voies et les principaux gènes impliqués dans la
différenciation des mélanocytes au cours du développement embryonnaire. .......................... 27
Figure 10 : Morphologie des mélanosomes par microscopie électronique à transmission. ..... 29
Figure 11 : 6\QPOqVH GHV GHX[ P\SHV GH PpOMQLQH HP UHSUpVHQPMPLRQ GX U{OH GHV SULQŃLSMOHVHQ]\PHVLPSOLTXpHV. ................................................................................................................ 30
- pluripotence est