[PDF] 2015GREAS014pdf - Thesesfr

214448

THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ GRENOBLE ALPES

Spécialité : Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Lionel BERTHOIN

Thèse dirigée par M. le Professeur Bertrand TOUSSAINT et codirigée par M. le Professeur Frédéric GARBAN Préparée au sein du Laboratoire TIMC-IMAG, équipe TheREx,

UMR 5525 CNRS/UJF

Dans l'École Doctorale l'École Doctorale Ingénierie pour la Santé, la

Cognition et l'Environnement (EDISCE)

Développement d'une méthode

innovante pour la génération sécurisée de cellules souches pluripotentes induites par transfert de protéines

Thèse soutenue publiquement le

Vendredi 2 Octobre 2015,

devant le jury composé de : M. le Pr. Bernard LEBLEU Président du jury, Rapporteur

Université Montpellier 2

M. le Dr. Guy ZUBER Rapporteur

Université de Strasbourg

Mme le Pr. Hélène LAPILLONNE Examinateur

Université Pierre-et-Marie-Curie, Paris

Mme le Dr. Fabienne BURLINA Examinateur

Université Pierre-et-Marie-Curie, Paris

M. le Dr. Laurent DAVID Examinateur

Université de Nantes

M. le Pr. Bertrand TOUSSAINT Directeur de thèse

Université Joseph Fourrier, Grenoble

M. le Pr. Frédéric GARBAN Co-Directeur de thèse

Université Joseph Fourier, Grenoble

M. le Dr. David LAURIN Co-Encadrant

Etablissement Français du Sang, Grenoble

REMERCIEMENTS

Confidentiel

1

Remerciements

Mes premiers remerciements vont à Monsieur le Professeur Benoît Polack, qui m'a accueilli au sein de

l'équipe TheRex depuis mon stage de M2. Merci Benoît pour ton investissement au cours de ce projet et pour

nous faire partager aussi bien tes connaissances que tes anecdotes.

Je souhaiterais exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Professeur Bertrand Toussaint, qui a dirigé mon

projet de thèse, mais aussi de M2. Merci Bertrand pour ta disponibilité, ta gentillesse ainsi que pour ton

enthousiasme communicatif, très utile pendant certaines périodes difficiles !! Ce fut un réel plaisir que de

travailler avec toi.

Merci à Monsieur le Professeur Frédéric Garban d'avoir co-dirigé ce travail de thèse. Frédéric, je te suis très

reconnaissant de m'avoir donné l'opportunité de participer à ce projet si prometteur, ainsi que de nous avoir

permis de travailler dans les meilleures conditions possibles.

J'adresse un immense merci (avec une mention toute particulière si tu préfères !) au Docteur David Laurin

pour m'avoir encadré (et supporté !) au quotidien pendant plus de trois ans. Je suis vraiment heureux d'avoir

pu travailler avec toi, dans les bons et les mauvais moments. Merci pour ta gentillesse et ta grande

disponibilité. J'ai beaucoup appris à tes côtés. Par contre j'attends toujours de goûter ton gâteau au chocolat !!

J'adresse mes sincères remerciements à Monsieur le Professeur Bernard Lebleu et Monsieur le Docteur Guy

Zuber, d'avoir accepté d'être les rapporteurs de cette thèse, ainsi qu'à Madame le Professeur Hélène

Lapillonne, Madame le Docteur Fabienne Burlina et Monsieur le Docteur Laurent David, d'avoir bien voulu

évaluer mes travaux.

Je suis également très reconnaissant envers Monsieur le Professeur Christophe Ribuot, Madame le Docteur

Delphine Aldebert ainsi que Monsieur le Professeur Michel Sève de m'avoir donné l'opportunité d'enseigner

au sein de l'UFR de Pharmacie.

Merci à Monsieur le Professeur Jean-Luc Lenormand, d'avoir guidé mes premiers pas dans le monde de

flammer les soirées TheREx sous le pseudo de DJ J2L !

Merci à Monsieur le Docteur Jean Breton, pour les discussions dans le couloir du 8e et la compagnie le

weekend.

Je souhaite également remercier vivement tous les membres de l'équipe TheRex ainsi que les APCuriens

pour tous les bons moments partagés ensemble au cours de ces dernières années, qui resteront pour moi

inoubliables et remplies de bons souvenirs : Amandine (tu as trop de surnoms mais je crois que mon préféré

restera Chinatown ! Merci à ma pom-pom girl n°1 !!), Anne-Laure (je ne sais pas quoi te dire mis à part de

ne surtout pas changer !), Audrey (merci de m'avoir encadré pendant mon stage !! Et je tiens à préciser que

je n'ai absolument pas participé au lancer de confetti !), Benjamin (bon courage pour la suite ! A toi

REMERCIEMENTS

Confidentiel

2

désormais de transmettre le signe ProTiPS aux prochaines générations !!), Benoit, Bertrand, Cécile, David,

DJ J2L, Erwan & Sylvain (les as du foot), Hélène (appelle moi quand tu fais un gâteau !), Julie B, Julie M, Julien (il Bastone ou le diot, au choix partie de pêche !), Landry (merci pour ta gentillesse Marie-Claire (le

gourou de la secte TheRex, encore merci pour les corrections et ton optimisme !), Mathieu (merci pour ton

soutien pendant la rédaction ! je compte sur toi pour faire résonner Calo au 8e !!), Muriel, Olivier

(nnnnnoooooonn!), Pascal, Pauline (mamie et son thé Merci à ma pom-

pom girl n°2), Rwanounet (oh mon dieu !), Wisia (je n'oublierais pas ton aide précieuse dans mes

recherches d'emploi !) et Yan.

Et tous ceux qui sont passés au labo, je ne vous ai pas oubliés : je pense notamment à mes anciens camarades

de thèse Roberta (tes injures en italien me manquent !!) Xavier C (mon pharmacien préféré !) et Charlotte

(c'était plutôt cool les petits pics qu'on s'envoyait !) mais aussi à Martin & Fred alias les Yamanaka's),

Hichem, Dalil, Xavier R, David (le Dude), Atanur, Elissar, Emmanuel Et tous ceux que j'ai oublié !

C'est en grande partie grâce à vous si venir au travail a été un bonheur quotidien, j'espère que nous pourrons

tous rester en contact !

Mille mercis à mes amis Grenoblois et d'ailleurs, pour tous les moments que nous avons partagés, tous les

fous rires, les voyages, et les actions (et les plans foireux !) dont on a le secret ! Un grand merci à Amélie,

Cico, Gaby, Guillaume, Jimmy, Julie, Karim, Momo, Pauline, Pierro, Raouf, les Lyonnaises et à tous

les autres !!!

Enfin, je remercie infiniment mes parents, qui m'ont toujours soutenu dans mes études comme dans mes

projets et grâce à qui j'ai pu faire ce petit bout de chemin ! ! Confidentiel 3!

TABLE DES MATIERES

4

Confidentiel

Table des matières

Tables des illustrations ___________________________________________________ 11 Abréviations ____________________________________________________________ 15 INTRODUCTION _______________________________________________________ 19 CHAPITRE 1 Cellules souches pluripotentes ____________________________________ 20 I. Définition de la pluripotence ___________________________________________________ 21 II. Cellules souches embryonnaires ES ______________________________________________ 21 III. Reprogrammation cellulaire ____________________________________________________ 23

1. Génération de cellules pluripotentes par transfert nucléaire _________________________ 24

2. Génération de cellules pluripotentes par fusion cellulaire ___________________________ 27

3. Cellules souches pluripotentes induites (iPS) ____________________________________ 28

i. Concept _______________________________________________________________ 28 ii. Etat de l'art ____________________________________________________________ 29

4. iPS versus Cellules ES ______________________________________________________ 30

i. Potentiel de différenciation ________________________________________________ 31 a. Concept de mémoire épigénétique des iPS _________________________________ 31 b. Persistance de l'expression des transgènes __________________________________ 31 ii. Intégrité génomique et stabilité du caryotype __________________________________ 32 iii. Evaluation de la sécurité in vivo ____________________________________________ 32 IV. Applications des cellules souches pluripotentes _____________________________________ 34

1. Modèles d'études en biologie fondamentale et appliquée ___________________________ 35

i. Tests toxicologiques _____________________________________________________ 35 ii. Modèles pathologiques et criblages de molécules thérapeutiques __________________ 35

2. Médecine régénérative ______________________________________________________ 37

i. Applications cliniques des cellules ES _______________________________________ 38 ii. Applications cliniques des iPS _____________________________________________ 39 a. Preuve de concept chez l'animal _________________________________________ 39 b. Premier essai clinique utilisant des iPS ____________________________________ 40 V. Limites des cellules pluripotentes et problèmes soulevés _____________________________ 41 CHAPITRE 2 Aspects moléculaires de la pluripotence ____________________________ 43 I. Régulation transcriptionnelle ___________________________________________________ 45

1. Oct4 ____________________________________________________________________ 47

2. Sox2 ____________________________________________________________________ 48

3. Nanog __________________________________________________________________ 49

4. Klf4 ____________________________________________________________________ 51

5. c-Myc ___________________________________________________________________ 52

6. Lin28a __________________________________________________________________ 54

II. Régulation épigénétique _______________________________________________________ 58

1. Marques épigénétiques des histones ___________________________________________ 59

i. Méthylation ____________________________________________________________ 59 ii. Acétylation ____________________________________________________________ 59

2. Marques épigénétiques de l'ADN _____________________________________________ 60

3. Importance de l'épigénétique dans le maintien de la pluripotence _____________________ 61

i. Myc est un acteur majeur des modifications épigénétiques propres aux cellules ES ____ 61 a. Myc dicte les capacités de prolifération des cellules ES _______________________ 61

TABLE DES MATIERES

Confidentiel

5 b. Inhibition de la différenciation des cellules _________________________________ 61 c. Maintien du réseau transcriptionnel de pluripotence __________________________ 62 ii. Les facteurs centraux OSN sont également impliqués dans la mise en place de marques épigénétiques _______________________________________________________________ 62 CHAPITRE 3 Génération d'iPS _______________________________________________ 63 I. Les grands mécanismes du processus de reprogrammation cellulaire par induction _________ 65

1. La phase d'initiation stochastique _____________________________________________ 67

2. Phase de maturation ________________________________________________________ 68

3. Phase de stabilisation _______________________________________________________ 69

II. Différentes méthodes de génération d'iPS _________________________________________ 69

1. Différents systèmes de reprogrammation _______________________________________ 70

i. Reprogrammation par transfert d'acides nucléiques _____________________________ 70 a. Les vecteurs intégratifs ________________________________________________ 70 b. Les vecteurs non intégratifs _____________________________________________ 78 c. Reprogrammation par transfert d'ARN ____________________________________ 82 ii. Reprogrammation par transfert de protéines ___________________________________ 84 a. Utilisation des CPP comme vecteurs de facteurs de reprogrammation ____________ 85 b. Autres méthodes de vectorisation de protéines pour la reprogrammation __________ 88 iii. Synthèse sur les systèmes de reprogrammation ________________________________ 89

2. Choix de la source de cellules ________________________________________________ 90

3. Différentes combinaisons de facteurs de transcription _____________________________ 91

4. Optimisation du processus de reprogrammation __________________________________ 93

i. Molécules favorisant la reprogrammation ____________________________________ 93 a. Modulation épigénétique _______________________________________________ 93 b. Modulation des voies de signalisation cellulaire _____________________________ 94 c. Génération d'iPS sans facteurs de transcription exogènes ______________________ 95 ii. Conditions de culture ____________________________________________________ 96 III. Caractérisation de la pluripotence _______________________________________________ 98 i. Caractérisation in vivo ___________________________________________________ 99 a. Formation de tératomes in vivo __________________________________________ 99 b. Transmission germinale ________________________________________________ 99 ii. Caractérisation in vitro __________________________________________________ 100 a. Analyse morphologique _______________________________________________ 100 b. Expression de gènes et marqueurs spécifiques de pluripotence _________________ 100 c. Formation de corps embryoïdes in vitro___________________________________ 101 d. Analyse du profil épigénétique _________________________________________ 101 CHAPITRE 4 Développement d'un vecteur non intégratif innovant pour la génération sécurisée d'iPS ____________________________________________________________ 102 I. Objectif du projet ___________________________________________________________ 103

THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ GRENOBLE ALPES

Spécialité : Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Lionel BERTHOIN

Thèse dirigée par M. le Professeur Bertrand TOUSSAINT et codirigée par M. le Professeur Frédéric GARBAN Préparée au sein du Laboratoire TIMC-IMAG, équipe TheREx,

UMR 5525 CNRS/UJF

Dans l'École Doctorale l'École Doctorale Ingénierie pour la Santé, la

Cognition et l'Environnement (EDISCE)

Développement d'une méthode

innovante pour la génération sécurisée de cellules souches pluripotentes induites par transfert de protéines

Thèse soutenue publiquement le

Vendredi 2 Octobre 2015,

devant le jury composé de : M. le Pr. Bernard LEBLEU Président du jury, Rapporteur

Université Montpellier 2

M. le Dr. Guy ZUBER Rapporteur

Université de Strasbourg

Mme le Pr. Hélène LAPILLONNE Examinateur

Université Pierre-et-Marie-Curie, Paris

Mme le Dr. Fabienne BURLINA Examinateur

Université Pierre-et-Marie-Curie, Paris

M. le Dr. Laurent DAVID Examinateur

Université de Nantes

M. le Pr. Bertrand TOUSSAINT Directeur de thèse

Université Joseph Fourrier, Grenoble

M. le Pr. Frédéric GARBAN Co-Directeur de thèse

Université Joseph Fourier, Grenoble

M. le Dr. David LAURIN Co-Encadrant

Etablissement Français du Sang, Grenoble

REMERCIEMENTS

Confidentiel

1

Remerciements

Mes premiers remerciements vont à Monsieur le Professeur Benoît Polack, qui m'a accueilli au sein de

l'équipe TheRex depuis mon stage de M2. Merci Benoît pour ton investissement au cours de ce projet et pour

nous faire partager aussi bien tes connaissances que tes anecdotes.

Je souhaiterais exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Professeur Bertrand Toussaint, qui a dirigé mon

projet de thèse, mais aussi de M2. Merci Bertrand pour ta disponibilité, ta gentillesse ainsi que pour ton

enthousiasme communicatif, très utile pendant certaines périodes difficiles !! Ce fut un réel plaisir que de

travailler avec toi.

Merci à Monsieur le Professeur Frédéric Garban d'avoir co-dirigé ce travail de thèse. Frédéric, je te suis très

reconnaissant de m'avoir donné l'opportunité de participer à ce projet si prometteur, ainsi que de nous avoir

permis de travailler dans les meilleures conditions possibles.

J'adresse un immense merci (avec une mention toute particulière si tu préfères !) au Docteur David Laurin

pour m'avoir encadré (et supporté !) au quotidien pendant plus de trois ans. Je suis vraiment heureux d'avoir

pu travailler avec toi, dans les bons et les mauvais moments. Merci pour ta gentillesse et ta grande

disponibilité. J'ai beaucoup appris à tes côtés. Par contre j'attends toujours de goûter ton gâteau au chocolat !!

J'adresse mes sincères remerciements à Monsieur le Professeur Bernard Lebleu et Monsieur le Docteur Guy

Zuber, d'avoir accepté d'être les rapporteurs de cette thèse, ainsi qu'à Madame le Professeur Hélène

Lapillonne, Madame le Docteur Fabienne Burlina et Monsieur le Docteur Laurent David, d'avoir bien voulu

évaluer mes travaux.

Je suis également très reconnaissant envers Monsieur le Professeur Christophe Ribuot, Madame le Docteur

Delphine Aldebert ainsi que Monsieur le Professeur Michel Sève de m'avoir donné l'opportunité d'enseigner

au sein de l'UFR de Pharmacie.

Merci à Monsieur le Professeur Jean-Luc Lenormand, d'avoir guidé mes premiers pas dans le monde de

flammer les soirées TheREx sous le pseudo de DJ J2L !

Merci à Monsieur le Docteur Jean Breton, pour les discussions dans le couloir du 8e et la compagnie le

weekend.

Je souhaite également remercier vivement tous les membres de l'équipe TheRex ainsi que les APCuriens

pour tous les bons moments partagés ensemble au cours de ces dernières années, qui resteront pour moi

inoubliables et remplies de bons souvenirs : Amandine (tu as trop de surnoms mais je crois que mon préféré

restera Chinatown ! Merci à ma pom-pom girl n°1 !!), Anne-Laure (je ne sais pas quoi te dire mis à part de

ne surtout pas changer !), Audrey (merci de m'avoir encadré pendant mon stage !! Et je tiens à préciser que

je n'ai absolument pas participé au lancer de confetti !), Benjamin (bon courage pour la suite ! A toi

REMERCIEMENTS

Confidentiel

2

désormais de transmettre le signe ProTiPS aux prochaines générations !!), Benoit, Bertrand, Cécile, David,

DJ J2L, Erwan & Sylvain (les as du foot), Hélène (appelle moi quand tu fais un gâteau !), Julie B, Julie M, Julien (il Bastone ou le diot, au choix partie de pêche !), Landry (merci pour ta gentillesse Marie-Claire (le

gourou de la secte TheRex, encore merci pour les corrections et ton optimisme !), Mathieu (merci pour ton

soutien pendant la rédaction ! je compte sur toi pour faire résonner Calo au 8e !!), Muriel, Olivier

(nnnnnoooooonn!), Pascal, Pauline (mamie et son thé Merci à ma pom-

pom girl n°2), Rwanounet (oh mon dieu !), Wisia (je n'oublierais pas ton aide précieuse dans mes

recherches d'emploi !) et Yan.

Et tous ceux qui sont passés au labo, je ne vous ai pas oubliés : je pense notamment à mes anciens camarades

de thèse Roberta (tes injures en italien me manquent !!) Xavier C (mon pharmacien préféré !) et Charlotte

(c'était plutôt cool les petits pics qu'on s'envoyait !) mais aussi à Martin & Fred alias les Yamanaka's),

Hichem, Dalil, Xavier R, David (le Dude), Atanur, Elissar, Emmanuel Et tous ceux que j'ai oublié !

C'est en grande partie grâce à vous si venir au travail a été un bonheur quotidien, j'espère que nous pourrons

tous rester en contact !

Mille mercis à mes amis Grenoblois et d'ailleurs, pour tous les moments que nous avons partagés, tous les

fous rires, les voyages, et les actions (et les plans foireux !) dont on a le secret ! Un grand merci à Amélie,

Cico, Gaby, Guillaume, Jimmy, Julie, Karim, Momo, Pauline, Pierro, Raouf, les Lyonnaises et à tous

les autres !!!

Enfin, je remercie infiniment mes parents, qui m'ont toujours soutenu dans mes études comme dans mes

projets et grâce à qui j'ai pu faire ce petit bout de chemin ! ! Confidentiel 3!

TABLE DES MATIERES

4

Confidentiel

Table des matières

Tables des illustrations ___________________________________________________ 11 Abréviations ____________________________________________________________ 15 INTRODUCTION _______________________________________________________ 19 CHAPITRE 1 Cellules souches pluripotentes ____________________________________ 20 I. Définition de la pluripotence ___________________________________________________ 21 II. Cellules souches embryonnaires ES ______________________________________________ 21 III. Reprogrammation cellulaire ____________________________________________________ 23

1. Génération de cellules pluripotentes par transfert nucléaire _________________________ 24

2. Génération de cellules pluripotentes par fusion cellulaire ___________________________ 27

3. Cellules souches pluripotentes induites (iPS) ____________________________________ 28

i. Concept _______________________________________________________________ 28 ii. Etat de l'art ____________________________________________________________ 29

4. iPS versus Cellules ES ______________________________________________________ 30

i. Potentiel de différenciation ________________________________________________ 31 a. Concept de mémoire épigénétique des iPS _________________________________ 31 b. Persistance de l'expression des transgènes __________________________________ 31 ii. Intégrité génomique et stabilité du caryotype __________________________________ 32 iii. Evaluation de la sécurité in vivo ____________________________________________ 32 IV. Applications des cellules souches pluripotentes _____________________________________ 34

1. Modèles d'études en biologie fondamentale et appliquée ___________________________ 35

i. Tests toxicologiques _____________________________________________________ 35 ii. Modèles pathologiques et criblages de molécules thérapeutiques __________________ 35

2. Médecine régénérative ______________________________________________________ 37

i. Applications cliniques des cellules ES _______________________________________ 38 ii. Applications cliniques des iPS _____________________________________________ 39 a. Preuve de concept chez l'animal _________________________________________ 39 b. Premier essai clinique utilisant des iPS ____________________________________ 40 V. Limites des cellules pluripotentes et problèmes soulevés _____________________________ 41 CHAPITRE 2 Aspects moléculaires de la pluripotence ____________________________ 43 I. Régulation transcriptionnelle ___________________________________________________ 45

1. Oct4 ____________________________________________________________________ 47

2. Sox2 ____________________________________________________________________ 48

3. Nanog __________________________________________________________________ 49

4. Klf4 ____________________________________________________________________ 51

5. c-Myc ___________________________________________________________________ 52

6. Lin28a __________________________________________________________________ 54

II. Régulation épigénétique _______________________________________________________ 58

1. Marques épigénétiques des histones ___________________________________________ 59

i. Méthylation ____________________________________________________________ 59 ii. Acétylation ____________________________________________________________ 59

2. Marques épigénétiques de l'ADN _____________________________________________ 60

3. Importance de l'épigénétique dans le maintien de la pluripotence _____________________ 61

i. Myc est un acteur majeur des modifications épigénétiques propres aux cellules ES ____ 61 a. Myc dicte les capacités de prolifération des cellules ES _______________________ 61

TABLE DES MATIERES

Confidentiel

5 b. Inhibition de la différenciation des cellules _________________________________ 61 c. Maintien du réseau transcriptionnel de pluripotence __________________________ 62 ii. Les facteurs centraux OSN sont également impliqués dans la mise en place de marques épigénétiques _______________________________________________________________ 62 CHAPITRE 3 Génération d'iPS _______________________________________________ 63 I. Les grands mécanismes du processus de reprogrammation cellulaire par induction _________ 65

1. La phase d'initiation stochastique _____________________________________________ 67

2. Phase de maturation ________________________________________________________ 68

3. Phase de stabilisation _______________________________________________________ 69

II. Différentes méthodes de génération d'iPS _________________________________________ 69

1. Différents systèmes de reprogrammation _______________________________________ 70

i. Reprogrammation par transfert d'acides nucléiques _____________________________ 70 a. Les vecteurs intégratifs ________________________________________________ 70 b. Les vecteurs non intégratifs _____________________________________________ 78 c. Reprogrammation par transfert d'ARN ____________________________________ 82 ii. Reprogrammation par transfert de protéines ___________________________________ 84 a. Utilisation des CPP comme vecteurs de facteurs de reprogrammation ____________ 85 b. Autres méthodes de vectorisation de protéines pour la reprogrammation __________ 88 iii. Synthèse sur les systèmes de reprogrammation ________________________________ 89

2. Choix de la source de cellules ________________________________________________ 90

3. Différentes combinaisons de facteurs de transcription _____________________________ 91

4. Optimisation du processus de reprogrammation __________________________________ 93

i. Molécules favorisant la reprogrammation ____________________________________ 93 a. Modulation épigénétique _______________________________________________ 93 b. Modulation des voies de signalisation cellulaire _____________________________ 94 c. Génération d'iPS sans facteurs de transcription exogènes ______________________ 95 ii. Conditions de culture ____________________________________________________ 96 III. Caractérisation de la pluripotence _______________________________________________ 98 i. Caractérisation in vivo ___________________________________________________ 99 a. Formation de tératomes in vivo __________________________________________ 99 b. Transmission germinale ________________________________________________ 99 ii. Caractérisation in vitro __________________________________________________ 100 a. Analyse morphologique _______________________________________________ 100 b. Expression de gènes et marqueurs spécifiques de pluripotence _________________ 100 c. Formation de corps embryoïdes in vitro___________________________________ 101 d. Analyse du profil épigénétique _________________________________________ 101 CHAPITRE 4 Développement d'un vecteur non intégratif innovant pour la génération sécurisée d'iPS ____________________________________________________________ 102 I. Objectif du projet ___________________________________________________________ 103