[PDF] Etude in vitro de limpact de la drogue ABX sur les macrophages

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THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

En biologie

École doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (IGMM)

Laboratoire collaboratif : CNRS UMR5535 / ABIVAX

Présentée par Christina BEGON-PESCIA

Le mardi 6 octobre 2020

Sous la direction de M. Jamal Tazi : Directeur de thèse et de Mme Claire Daien : co-Directrice de thèse

Devant le jury composé de

Stephen Baghdiguian, Professeur, Université de Montpellier Florence Niedergang, DR2, CNRS, Institut Cochin, Paris 14

Arnaud Jacquel, CR, Sophia Antipolis, Nice

Céline Cougoule, CR, IPBS, Toulouse

Jamal Tazi, Professeur, ABIVAX, Montpellier

Claire Daien PHU, CNRS/ABIVAX, Montpellier

Président, Examinateur

Examinatrice

Rapporteur

Rapportrice

Directeur de thèse

Co-directrice de thèse

Etude in vitro de l'impact de la drogue ABX sur les macrophages primaires humains issus de monocytes du sang périphérique dans un contexte inflammatoire

Implication du micro-ARN 124

2 3 "Ceux qui abandonnent ne gagnent jamais, ceux qui gagnent n'abandonnent jamais." Steve Jobs

A ma famille...

mon père, ma mère, mon mari Pierre, mon fils Ianis et ma fille Léane 4 5 Je tiens tout d'abord à remercier les membres du jury d'avoir accepté d'évaluer mon travail

de thèse. Un grand merci à Arnaud Jacquel et à Céline Cougoule qui ont accepté d'être les

rapporteurs de mon mémoire de thèse. Je remercie également Stephen Baghdiguian et Florence Niedergang pour avoir accepté d'être les examinateurs de mon travail de thèse. Cher Jamal Tazi, merci pour ta confiance, merci de m'avoir donné la possibilité de mener ce

projet de recherche, mais surtout merci d'avoir accepté que ce projet soit mis en valeur à travers

ma thèse. Un grand merci à tous mes collègues ainsi qu'aux différentes directions de l'Institut de

Génétique Moléculaire de Montpellier (Jean-Marie Blanchard, Marc Piechaczyk et Etienne Schwob)

pour m'avoir supporté et encouragé au cours de ces 18 années passées à l'Institut. Et pour finir je remercie avec beaucoup d'émotions ma famille et tous mes amis et amies

qui m'ont aidé à ne pas abandonner au cours de cette dernière année. Cette dernière année a été

une remise en question permanente quant à l'alignement de mes valeurs. Cette thèse est certes un projet scientifique d'équipe, mais elle représente pour moi tout

l'investissement professionnel et personnel que j'ai pu avoir au cours de ces 18 années passées à

l'Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier.

Un grand Merci !

6 7

THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

En biologie

École doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (IGMM)

Laboratoire collaboratif : CNRS UMR5535 / ABIVAX

Présentée par Christina BEGON-PESCIA

Le mardi 6 octobre 2020

Sous la direction de M. Jamal Tazi : Directeur de thèse et de Mme Claire Daien : co-Directrice de thèse

Devant le jury composé de

Stephen Baghdiguian, Professeur, Université de Montpellier Florence Niedergang, DR2, CNRS, Institut Cochin, Paris 14

Arnaud Jacquel, CR, Sophia Antipolis, Nice

Céline Cougoule, CR, IPBS, Toulouse

Jamal Tazi, Professeur, ABIVAX, Montpellier

Claire Daien PHU, CNRS/ABIVAX, Montpellier

Président, Examinateur

Examinatrice

Rapporteur

Rapportrice

Directeur de thèse

Co-directrice de thèse

Etude in vitro de l'impact de la drogue ABX sur les macrophages primaires humains issus de monocytes du sang périphérique dans un contexte inflammatoire

Implication du micro-ARN 124

8 9

TABLE DES MATIERES

S ________________________________________

Résumé............................................................................................................ p.13

Partie 1 Etat de l'Art / Revue bibliographique.............................................p.15

Avant - propos...................................................................................................p.17

Chapitre 1 Généralités sur l'inflammation.......................................................p.19

I- L'inflammation..............................................................................p.21

1- Définition.....................................................................................p.21

2- Les médiateurs cellulaires.............................................................p.23

3- Les médiateurs chimiques............................................................ p.49

II- Les différents types d'inflammation............................................. p.69

1- L'inflammation aigüe.................................................................. p.69

2- L'inflammation chronique............................................................ p.70

Chapitre 2 Généralités sur l'immunité.............................................................p.77

I- Le système immunitaire inné.........................................................p.81

1- Les Récepteurs " Toll-Like » (TLR)................................................ p.83

2- Le TLR4 et sa voie de signalisation.................................................p.91

3- Les Récepteurs " NOD Like » (NLR)................................................ p.95

4- L'inflammasome NLRP3............................................................... p.99

II- Le système immunitaire adaptatif................................................ p.101 Chapitre 3 Les monocytes et les macrophages humains dans l'inflammation...p.113

I- Les monocytes ...............................................................................p.115

1- Hétérogénéité des monocytes.........................................................p.115

2- Les monocytes dans les maladies inflammatoires chroniques............ p.121

II- Les macrophages...........................................................................p.123 10

1- Hétérogénéité et nomenclature liée au micro-environnement des macrophages.......................................................................... p.123

2- Les molécules de communication impliquées dans les polarisations....... p.131

3- Les déterminants moléculaires de la polarisation............................... p.137

4- La polarisation des macrophages dans les inflammations chroniques.... p.138

Chapitre 4 Les micro-ARN : régulateurs des réponses inflammatoires............... p.143

I- Généralités sur les micro-ARN......................................................... p.145

1- Biogenèse et mécanismes d'action des micro-ARN............................... p.145

2- Les micro-ARN dans le système immunitaire..................................... p.147

II- Régulation de l'inflammation par les micro-ARN............................ p.151

1- Effets anti-inflammatoires des micro-ARN........................................ p.151

2- Rôle des micro-ARN dans la polarisation des macrophages.................. p.155

3- Le micro-ARN 124......................................................................... p.165

Partie 2 Travaux de recherche...................................................................... p.171

1- Résumé............................................................................................. p.172

2- Introduction....................................................................................... p.175

3- Matériels et méthodes........................................................................... p.178

4- Résultats........................................................................................... p.188

5- Discussion........................................................................................ p.216

Partie 3 Conclusion / perspectives............................................................... p.229

Références bibliographiques................................................................................ p.245

Annexes

11 12 13

Résumé

________________________________________

Les macrophages sont des médiateurs cellulaires hétérogènes, dont le rôle est crucial dans

l'inflammation. Une molécule chimique ABX a été développée par la société privée ABIVAX et

fait actuellement l'objet d'essais cliniques de phase II (colite ulcéreuse, polyarthrite rhumatoïde).

En collaboration avec le CNRS, il a été observé que cette drogue ABX est un puissant anti- inflammatoire capable d'induire spécifiquement la surexpression du miR-124, décrit pour ses

propriétés anti-inflammatoires. L'objectif de mon projet de thèse a été de caractériser in vitro, les

modulations phénotypiques et les mécanismes moléculaires mis en jeu par la drogue ABX, sur des macrophages humains dérivés de monocytes (Hu MDM) de donneurs sains dans un contexte

inflammatoire, et prétraités par la drogue ABX versus contrôle. Les données obtenues sur 6 Hu

MDM montrent d'une part, une diminution significative des récepteurs membranaires du phénotype M1 (CD86, CD274), et d'autre part, une diminution significative des facteurs

l'analyse du profil sécrétoire montre une diminution significative d'un ensemble de protéines pro-

inflammatoires, à savoir : des cytokines (IL-6, TNFα, IL-1β), des protéines impliquées dans

l'adhésion cellulaires et le recrutement des leucocytes (ICAM-1, CXCL1), ainsi que la chimiokine responsable de l'infiltration des macrophages (MCP-1/ CCL2). Fait remarquable, les données obtenues avec 14 HuMDM, montrent une surexpression significative du micro-ARN 124 de 3,4

fois par rapport au contrôle. Somme toute, l'ensemble de ces données suggère que la drogue ABX,

limite l'excès d'inflammation, et jouerait un rôle dans le contrôle de l'homéostasie cellulaire. La

surexpression du miR-124 est en concordance avec les données obtenues in vitro sur les

lymphocytes T CD4 et les PBMC humains, mais également avec les données cliniques obtenues

avec des patients atteints de colite ulcéreuse. Finalement, le laboratoire identifie, pour la

première fois le potentiel immunorégulateur de la drogue ABX dans l'inflammation. En induisant la surexpression spécifique du miR-124, la drogue ABX, atténue le profil pro-inflammatoire des

macrophages par un rétrocontrôle négatif de la voie TLR4/NF-kB. Le miR-124 potentialise l'effet

homéostatique de la drogue ABX. Cette nouvelle molécule chimique ABX pourrait représenter

une nouvelle perspective thérapeutique, visant à rééquilibrer certains médiateurs impliqués

dans l'immunité innée et adaptative. Mots-clés : macrophages, inflammation, drogue ABX, micro-ARN 124, TLR4, NF-kB 14 15 ________________________________________

Partie 1

Etat de l'Art / Revue bibliographique

________________________________________ 16 17

Avant-propos

s ________________________________________

La régulation du système immunitaire est un élément crucial dans le maintien de

l'homéostasie corporelle. En effet, le système immunitaire qui nous protège contre les infections

peut aussi provoquer de nombreux effets négatifs sur nos propres cellules et tissus et ainsi provoquer des inflammations par exemple. Le fonctionnement du système immunitaire dont la fonction première est de nous protéger contre les infections, implique de nombreux organes, de cellules, de molécules, et de voies de signalisation tout au long de processus interconnectés. Les avancés en imagerie cellulaire, en génétique, en bio-informatique, de même qu'en

biologie cellulaire et moléculaire, ont permis à la communauté scientifique de mieux connaitre

l'ensemble des facteurs mis en jeu. Le système immunitaire interagit avec tous les systèmes

endocriniens, nerveux, digestif, cardio-vasculaire pour reconnaitre et détruire tout ce qui

n'appartient pas à l'organisme. Je commencerai par vous présenter dans un premier chapitre l'inflammation de manière

globale. Ce premier chapitre me permettra de présenter les médiateurs cellulaires et chimiques,

qui sont responsables de l'inflammation. Dans ce chapitre, j'aborderai également dans les

grandes lignes les inflammations chroniques à caractère auto-immuns (maladies chroniques de

l'intestin et la polyarthrite rhumatoïde). Ces pathologies font actuellement l'objet d'études

cliniques de phase II avec la drogue ABX utilisée dans mes travaux de recherche (nouvelle

molécule chimique antirétroviral et anti-inflammatoire ; développée par la société privée

ABIVAX). Et ce n'est qu'après avoir discuté de la complexité du système immunitaire dans le

deuxième chapitre, que j'attirerai votre attention sur le rôle des monocytes avant de détailler

celui des macrophages dans un troisième chapitre. Pour finir, c'est dans un quatrième chapitre, que je discuterai de l'implication des micro-

ARN qui interviennent en tant que régulateurs des réponses inflammatoires. Enfin, je clôturerai

cet état de l'art en me focalisant sur le micro-ARN 124, qui semble être la clé, des puissants effets

anti-inflammatoires observés en clinique et qui, d'après les études in vitro que j'ai pu mener sur

les macrophages, le miR-124 aurait un rôle dans le maintien de l'homéostasie. Finalement,

j'espère qu'à la suite de la présentation de mes travaux de recherche, je réussirai à vous

convaincre que le développement de petites molécules chimiques comme la drogue ABX, pourrait

représenter une nouvelle perspective thérapeutique, dont la première intention, serait de traiter

les inflammations excessives en " rééquilibrant » tous les acteurs impliqués dans le système

immunitaire inné et adaptatif. 18 19 20

Figure 1 : Les principaux évènements de la réaction inflammatoire localisée. Les mastocytes (cellules du

tissus conjonctif) libèrent de l'histamine, tandis que les macrophages sécrètent des cytokines. Ces médiateurs vont

provoquer la dilatation des capillaires qui deviennent perméables. Les médiateurs chimiques libérés attirent les

neutrophiles (diapédèse des neutrophiles) qui, tout comme les macrophages vont digérer les agents pathogènes.

21
L'inflammation est un phénomène connu depuis l'époque des Egyptiens selon le Dr Sahar Saleem (Professeure de radiologie à l'université du Caire). Cette notion d'inflammation sera reprise de façon plus précise par Cornelius Celsius au 1 er siècle avant JC (Netea et al., 2017). Les

aspects qu'il cite représentent " 4 cardinaux » qui restent d'actualités de nos jours: " Tumor »

(oedème), " Rubor » (rougeur), " Calor » (chaleur) " Dolor » (douleur) (Alessandri et al., 2013).

Cette description se trouve modulée dans le temps, car entre 1850 et 1860, Rudolph Virchow

(anatomo-pathologiste), rajoute à ces signes la notion de fonctionnalité: " Fonctio Loesa » (perte

de fonction). Cette dernière notion va alors initier l'importance du maintien de l'intégrité du

" soi » (soit l'homéostasie). Plus tard entre 1876 et 1885, Robert Koch et Louis Pasteur, faisant

suite à leurs études d'identification des microorganismes et de la vaccination, confirment que ces

" 5 cardinaux » décrivent les évènements principaux mis en jeu lors d'une inflammation.

Enfin, Elie Metchnikoff, en 1884 développa la notion de " macrophages » : cellules qui

réduisent les corps étrangers qui ont pénétré l'organisme, et il les qualifia de " microphages » ;

celles qui sont connues aujourd'hui sous le nom de granulocytes neutrophiles. Il est ainsi le

premier qui ait saisi l'importance de ces cellules dans la résolution de l'inflammation. Cependant,

en 1917, Ludwig Aschoff mentionnait la difficulté de déterminer les aspects bénéfiques ou

néfastes de l'inflammation. Ainsi, la notion " globale » de l'inflammation fut abandonnée. Il a

fallu attendre les années 80 et la découverte d'une spécificité de la réponse inflammatoire en

fonction du type d'agresseur, pour distinguer l'inflammation aigüe de l'inflammation chronique.

Notez que j'aborderai ces notions un peu plus loin. Alors finalement comment définit-on

l'inflammation de nos jours ? L'inflammation, ou la réaction inflammatoire, est un mécanisme naturel qui se met en place quand l'organisme subit une agression : chimique, toxique, microbienne, traumatique, environnementale. Ce processus réactionnel de défense permet d'assurer le maintien de

l'intégrité du " soi ». La réaction inflammatoire est essentiellement locale et elle entraine une

mobilisation de cellules qui jouent un rôle important. On distingue principalement les leucocytes,

comme les neutrophiles et les macrophages Figure 1. 22

Figure 2 : Les médiateurs cellulaires et chimiques de l'inflammation. Les cellules de l'inflammation sont des

cellules de la circulation sanguine. On distingue des neutrophiles, des lymphocytes, des monocytes, des macrophages

et des mastocytes ; source de médiateurs moléculaires de l'inflammation (histamines, cytokines et chimiokines).

23 Localement ces cellules sécrètent des médiateurs chimiques, comme des cytokines et des

chimiokines, qui vont induire une vasodilatation des vaisseaux. Cette dilatation des vaisseaux

permet l'afflux d'autres cellules (par un phénomène de diapédèse) qui viennent aider à lutter

contre l'agression. Cependant, si l'inflammation ne peut pas être contrôlée, le système de défense

devient de plus en plus important, avec la mise en place d'une réponse plus complexe du système

immunitaire (immunité innée et adaptative). Je décrirai ces notions dans le chapitre de

l'immunité. La réaction inflammatoire est indispensable à l'organisme : elle permet l'élimination des agresseurs et la réparation des lésions. L'inflammation fait intervenir essentiellement des cellules comme les granulocytes (neutrophiles), les monocytes/macrophages et les lymphocytes Figure 2. Plus la réaction inflammatoire va durer, plus les populations de leucocytes impliquées seront nombreuses. Au

début de l'inflammation, ce sont surtout les polynucléaires neutrophiles qui vont être mobilisés.

Les neutrophiles sont les cellules les plus spécialisées, du système immunitaire tout comme les

macrophages (Franken et al., 2016) et les lymphocytes T et B (Walzer et al., 2000). Cet ensemble de cellules pourra être mobilisé, selon l'importance de l'agression. Le processus inflammatoire est un processus complexe qui implique une série d'événements

cellulaires et biochimiques interdépendants essentiels au déclenchement de la réparation des

tissus endommagés (Medzhitov et al., 2012). L'inflammation fait intervenir des médiateurs

moléculaires qui interviennent dans les premiers temps de l'inflammation (histamines, cytokines, chimiokines pro-inflammatoires) Figure 2. Ces médiateurs sont produits localement par les tissus enflammés. Ces molécules sont nombreuses et complexes. Actuellement certaines sont la cible d'action de traitements anti-inflammatoires (comme par exemple les cytokines : TNF ou IL-12/IL-23). Je discuterai de ces médiateurs chimiques un peu plus loin. Mais avant de

décrire plus en détail les différents types d'inflammations que sont l'inflammation aigüe et

l'inflammation chronique, le paragraphe suivant, présente succinctement les cellules impliquées

et responsables de l'inflammation. Les cellules qui interviennent dans les mécanismes de l'inflammation sont des cellules circulantes, des polynucléaires neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes et des cellules résidentes du tissu conjonctif local, comme les macrophages, les mastocytes et les 24

Figure 3 : Ontogénie des granulocytes, monocytes / macrophages, et des lymphocytes (d'après Orkin and

Zon, 2008). Les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) sont à l'origine de l'ensemble des cellules de la circulation

sanguine. Les CSH vont se différencier pour générer (1) les progéniteurs myéloïdes communs qui se différencieront en

granulocytes, monocytes et macrophages, représentant les cellules de l'immunité innée et générer (2) les progéniteurs

lymphoïdes qui après différenciation vont générer les lymphocytes (B et T) mais également les cellules " Natural

Killer » (NK) ; cellules de l'immunité adaptatives.

25 cellules dendritiques, qui représentent des cellules sentinelles (Franken et al., 2016). En effet,

ces cellules expriment des récepteurs de l'immunité innée qui sera développée plus loin, et sont

capables de détecter des agents infectieux dangereux pour l'organisme. Par ailleurs, il est important de préciser ici que, les cellules de l'inflammation sont des

cellules issues à la fois des progéniteurs myéloïdes de la moelle osseuse (cellules de l'immunité

innée) (Orkin and Zon, 2008) Figure 3 et se trouvent régulées (maturation et prolifération) par

des facteurs solubles comme par exemple le " Monocyte-Colony Stimulating Factor » (M-CSF), le

" Granulocyte Macrophage-CSF » (GM-CSF), et le " Fetal liver tyrosine kinase 3 Ligand » (Flt3L)

(Way et al., 2009) et issues des progéniteurs lymphoïdes, comme les cellules " Natural Killer »

(NK) et les lymphocytes B et T (cellules de l'immunité adaptative) Figure 3.

Par ailleurs, les cellules de l'immunité sont capables de faire la différence entre les cellules

" du soi » et les cellules du " non soi » (Janeway et al., 1996) et cette distinction se fait, grâce à ce

que l'on appelle le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH), qui se trouve présent à la

surface de toutes les cellules nucléées de l'organisme s'il s'agit du CMH de la classe I, et se trouve

uniquement présent sur les cellules immunitaires s'il s'agit du CMH de classe II (Olsen Saraiva Camara et al., 2012). De plus, les cellules immunitaires sont identifiées par des récepteurs

membranaires que l'on appelle : " Cluster de Différenciation » (CD). Ces CD sont utilisés comme

marqueur pour l'identification des cellules (Israels and Israels, 1999).quotesdbs_dbs32.pdfusesText_38

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