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Comment définir une mutation ?
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Quels sont les 2 types de mutation ?
Mutations ponctuelles
Mutations faux sens : Cette mutation ponctuelle se traduit par le remplacement d'un nucléotide par un autre. Mutations non-sens : Le changement d'un nucléotide provoque le remplacement d'un codon spécifiant un acide aminé par un codon-stop.
Les mutations sont des modifications du matériel génétique. Elles peuvent avoir des conséquences délétères (rarement avantageuses) sur l'organisme. Elles intéressent le généticien qui crée des mutations pour en étudier les processus. Elles sont à l'origine des modifications évolutives.

Plan du cours "Biologie du

développement»

Partie I : Notions de base de la biologie du

développement. Les facteurs moléculaires contrôlant les processus de base : différenciation et communication cellulaire ,morphogenèse gènes.

Partie 2 : Le développement du xénope et du

zebrafish: Le Xénope : gènes et facteurs régulateurs impliqués durant les premiers stades Le zebrafish ou poisson-zèbre : gènes et facteurs régulateurs .Le "remodelage» du mésoderme (somitogenèse, formation

Le "remodelage

Les techniques utilisées en

biologie du développement -au niveau de la protéine

2) Etude de la fonction des gènes

AEApproches génétiques

mutation de gènes -par mutagenèse aléatoire (génétique classique ou "directe») -par mutagenèse ciblée (Génétique inverse) inactivation ou surexpression ciblée

Génétique "directe»

GENE fonction (phénotype)

Génétique inverse

AEEtude de la fonction des gènes

3) Embryologie expérimentale:

Etude des cellules et tissus par :

-Transplantations et explants -Marquages cellulaires

1) Par RT-PCR

-Extraction de RNA de différents tissus -Réverse Transcription -Analyse des fragments par electrophorèse sur gel AE de développement

N.B. :

-très sensible (Requiert peu de tissu) -localisation

Approximative

-Nbre limité de gènes étudiés (-quantitatif si

PCR en temps

réel)

3) "Micropuces» (Microarrays)

(totalité des gènes)

AEComparaison de

2échantillons

Par exemple:

-2 tissus différents -1 tissus à 2 stades -1 tissus +/-traitement -WT ÅAEmuté

Désavantage :

-Pas de localisation précise

3 bis : RNA-seq

Séquençage à haut débit des cDNA (AE50-100 millions de seq.) Exemple : RNA-seq de cellules beta pancréatiques

Avantages :

-très sensible -Applicable à des génomes non séquencés (non annotés) AEdécouverte de nouveaux transcripts AEHlxb9 est exprimé dans les cellules beta et pas le gène Arx

4) Par hybridation in situ sur embryons entiers

Sondes :

ARN complémentaires

(Radioactif) ou lié à un épitope (digoxigénine ou fluorescéine) de zebrafish entier SOX4b AE Désavantage : nombre limité de gènes étudiés PTF1a

Cel. Crêtes neurales

pancréas

Cerveau postérieur

pancréas (pour gros embryons opaques)

AELocalisation

précise dans

Exemple:

Expression du gène SOX4 dans le pancréas et

e16 : 16 ième jour embryonnaire)

AEImmunohistochimie ou immunofluorescence

AbN°1 AEProtéine

AbN°2 (anti-IgG souris)

-couplé à un fluorophore (FITC, TexasRed -couplé à une Enzyme (Alkaline Phosphatase ) AEreaction

Exemple

-noir : ARNm sox4 (révélé par hybridation in situ) -vert :Ab anti-insuline (+ anti IgG-lapin-FITC), -rouge : Ab-glucagon (+ anti-IgG-souris-TexasRed) glu ins AELocalisation précise de la protéine dans le tissu

ARNm sox4

N.B.: Nécessite un anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine étudiée.

2) Etude de la fonction des gènes.

A)approches génétiques.

AEmutation ou délétionde gènes

Rappel de notions de base

-Mutations induites ou spontanées. -mutations ponctuelles (substitutions ou "frame shift»)(mutagènes chimiques, exemple ENU) transposon ou retrovirus )

A) pertes de fonction

-complète ("null») -partielles (hypomorphe)

AEsérie allélique

B) Gain de fonction

(activation constitutive du produit du gène)

AEmutation dominante

Hypomorphes

"null»

Rappel de notions de base

Animaux diploide : (chromosome paternel et maternel) AEMutant hétérozygote (+/-) ÅAEhomozygote (-/-) mutation récessiveAEphénotype normal (hétérozygotes) (majorité : "perte de fonction») mutation dominanteAEphénotype anormal (het.) mutation semidominanteAEphénotype observable (het.) + phénotype anormal (hom.) (minorité; haploinsuffisance, perte de fonction 50% -> anomalie) (Majorité des gènes) (minorité de gènes)

Transmission des caractères à la

descendance (lois de Mendel)

Dans le cas de mutations:

Généralement : mutations récessives

Pas de phénotype au niveau de F2

Mutations semi-dominantes ("haploinsuffisance») Phénotype muté dans 50% de F2 (hétérozyg.)

Mutations dominantes : 50% au niveau de F2

(mutation "gain de fonction» et transgéniques) F1 F2 F3 A: Identification de mutations récessives affectant le développement : génétique "directe»

AEIdentification de milliers de mutants (1996)

(Stratégie similaire pour la drosophile et C. elegans) Prix Nobel 1995: Nusslein-Volhard, Wieschaus & Lewis

AEAnalyse du phénotype.

AEIdentification du gène muté

(si mutation induite par insertion de transposons ou rétrovirus: AE si mutation ponctuelle induite par un mutagène :

AEcartographie par utilisation de marqueurs

polymorphiques AE marqueur polymorphique proche de la mutation : "mapcross» Souche Tu (mutante)Autre souche (WIK, non mutée) Identification des mutations par séquençage à haut débit AE- "mapcross» :

Exemple :

Chr. 20 portant la

mutation X : DNA souche Tu : DNA souche WIK

Région homozygote portant la mutation

AESNP» affectant un gène

B: Etude de la fonction des gènes par

"génétique inverse» Gène identifié (cloné) AEQuel est sa fonction ?

AEmodification -de son expression

-de son activité et analyse du phénotype

Tests de "Perte de fonction»

A)par délétion/mutation ciblée du gène ("knock-out»)

AEinactivation complète du gène

B) par diminution de son expression

("knock-down»)

AEinactivation -partielle

-(presque) complète

Tests de "Gain de fonction»

C) par surexpression ou expression ectopique

A) La technique de délétion de gène ("Knock-out»)

1)Construction du gène invalidé

(par clonage en bactéries)(B)

2)Introduction dans les cellules

ES (cellules totipotentes) (A)

(par transfection ) et recombinaison homologue

3)Implantation des cellules ES

dans les blastocystes

4)Sélection des chimères

5)Identification des animaux

hétérozygotes

6)Génération des homozygotes

Fig. 4.20 p 96 Scott Gilbert

(Prix Nobel à Cappechi, Evans et Smithies pour

La technique de Knock-out chez la souris)

"knock-out conditionnel ou

à différents stades de développement AE

Invalidation du gène -dans un tissus

2)Expression de la recombinase CRE (croisement

avec souris transgénique exprimant CRE)

Remarque :

Technique de "knock-out» par recombinaison

homologue :uniquement modèle souris Cause : pas de lignées cellulaires ES pour les autres modèles colonisant la lignée germinale jusque 2012 Mutagenèse ciblée de gène par les nucléases "Zinc finger Nucleases»,TALEN et CRISPR (From Streptotocus pyogenes)CRISPR/Cas9 (2012) (2011)(2008) Fok1

Le domaine en doigt de

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[PDF] IV) Les techniques utilisées en Biologie du développement

Quelles sont les 3 types de mutation ?

Comment définir une mutation ?

Quels sont les 2 types de mutation ?

Mutations ponctuelles

Plan du cours "Biologie du

Partie I : Notions de base de la biologie du

Partie 2 : Le développement du xénope et du

Le "remodelage

Les techniques utilisées en

2) Etude de la fonction des gènes

AEApproches génétiques

Génétique "directe»

Génétique inverse

AEEtude de la fonction des gènes

3) Embryologie expérimentale:

Etude des cellules et tissus par :

1) Par RT-PCR

N.B. :

Approximative

PCR en temps

3) "Micropuces» (Microarrays)

AEComparaison de

2échantillons

Par exemple:

Désavantage :

3 bis : RNA-seq

Avantages :

4) Par hybridation in situ sur embryons entiers

Sondes :

ARN complémentaires

Cel. Crêtes neurales

Cerveau postérieur

AELocalisation

Exemple:

Expression du gène SOX4 dans le pancréas et

AEImmunohistochimie ou immunofluorescence

AbN°1 AEProtéine

AbN°2 (anti-IgG souris)

Exemple

ARNm sox4

2) Etude de la fonction des gènes.

A)approches génétiques.

AEmutation ou délétionde gènes

Rappel de notions de base

A) pertes de fonction

AEsérie allélique

B) Gain de fonction

AEmutation dominante

Hypomorphes

Rappel de notions de base

Transmission des caractères à la

Dans le cas de mutations:

Généralement : mutations récessives

Pas de phénotype au niveau de F2

Mutations dominantes : 50% au niveau de F2

AEIdentification de milliers de mutants (1996)

AEAnalyse du phénotype.

AEIdentification du gène muté

AEcartographie par utilisation de marqueurs

Exemple :

Chr. 20 portant la

Région homozygote portant la mutation

AESNP» affectant un gène

B: Etude de la fonction des gènes par

AEmodification -de son expression

Tests de "Perte de fonction»

AEinactivation complète du gène

B) par diminution de son expression

AEinactivation -partielle

Tests de "Gain de fonction»

C) par surexpression ou expression ectopique

1)Construction du gène invalidé

2)Introduction dans les cellules

ES (cellules totipotentes) (A)

3)Implantation des cellules ES

4)Sélection des chimères

5)Identification des animaux

6)Génération des homozygotes

Fig. 4.20 p 96 Scott Gilbert