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Quelles sont les 3 types de mutation ?
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Apparition brusque, dans tout ou partie des cellules d'un être vivant, d'un changement dans la structure de certains gènes, transmis aux générations suivantes si les gamètes sont affectés.Quels sont les 2 types de mutation ?
Mutations ponctuelles
Mutations faux sens : Cette mutation ponctuelle se traduit par le remplacement d'un nucléotide par un autre. Mutations non-sens : Le changement d'un nucléotide provoque le remplacement d'un codon spécifiant un acide aminé par un codon-stop.- Les mutations sont des modifications du matériel génétique. Elles peuvent avoir des conséquences délétères (rarement avantageuses) sur l'organisme. Elles intéressent le généticien qui crée des mutations pour en étudier les processus. Elles sont à l'origine des modifications évolutives.
Plan du cours "Biologie du
développement»Partie I : Notions de base de la biologie du
développement. Les facteurs moléculaires contrôlant les processus de base : différenciation et communication cellulaire ,morphogenèse gènes.Partie 2 : Le développement du xénope et du
zebrafish: Le Xénope : gènes et facteurs régulateurs impliqués durant les premiers stades Le zebrafish ou poisson-zèbre : gènes et facteurs régulateurs .Le "remodelage» du mésoderme (somitogenèse, formationLe "remodelage
Les techniques utilisées en
biologie du développement -au niveau de la protéine2) Etude de la fonction des gènes
AEApproches génétiques
mutation de gènes -par mutagenèse aléatoire (génétique classique ou "directe») -par mutagenèse ciblée (Génétique inverse) inactivation ou surexpression cibléeGénétique "directe»
GENE fonction (phénotype)Génétique inverse
AEEtude de la fonction des gènes
3) Embryologie expérimentale:
Etude des cellules et tissus par :
-Transplantations et explants -Marquages cellulaires1) Par RT-PCR
-Extraction de RNA de différents tissus -Réverse Transcription -Analyse des fragments par electrophorèse sur gel AE de développementN.B. :
-très sensible (Requiert peu de tissu) -localisationApproximative
-Nbre limité de gènes étudiés (-quantitatif siPCR en temps
réel)3) "Micropuces» (Microarrays)
(totalité des gènes)AEComparaison de
2échantillons
Par exemple:
-2 tissus différents -1 tissus à 2 stades -1 tissus +/-traitement -WT ÅAEmutéDésavantage :
-Pas de localisation précise3 bis : RNA-seq
Séquençage à haut débit des cDNA (AE50-100 millions de seq.) Exemple : RNA-seq de cellules beta pancréatiquesAvantages :
-très sensible -Applicable à des génomes non séquencés (non annotés) AEdécouverte de nouveaux transcripts AEHlxb9 est exprimé dans les cellules beta et pas le gène Arx4) Par hybridation in situ sur embryons entiers
Sondes :
ARN complémentaires
(Radioactif) ou lié à un épitope (digoxigénine ou fluorescéine) de zebrafish entier SOX4b AE Désavantage : nombre limité de gènes étudiés PTF1aCel. Crêtes neurales
pancréasCerveau postérieur
pancréas (pour gros embryons opaques)AELocalisation
précise dansExemple:
Expression du gène SOX4 dans le pancréas et
e16 : 16 ième jour embryonnaire)AEImmunohistochimie ou immunofluorescence
AbN°1 AEProtéine
AbN°2 (anti-IgG souris)
-couplé à un fluorophore (FITC, TexasRed -couplé à une Enzyme (Alkaline Phosphatase ) AEreactionExemple
-noir : ARNm sox4 (révélé par hybridation in situ) -vert :Ab anti-insuline (+ anti IgG-lapin-FITC), -rouge : Ab-glucagon (+ anti-IgG-souris-TexasRed) glu ins AELocalisation précise de la protéine dans le tissuARNm sox4
N.B.: Nécessite un anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine étudiée.2) Etude de la fonction des gènes.
A)approches génétiques.
AEmutation ou délétionde gènes
Rappel de notions de base
-Mutations induites ou spontanées. -mutations ponctuelles (substitutions ou "frame shift»)(mutagènes chimiques, exemple ENU) transposon ou retrovirus )A) pertes de fonction
-complète ("null») -partielles (hypomorphe)AEsérie allélique
B) Gain de fonction
(activation constitutive du produit du gène)AEmutation dominante
WTHypomorphes
"null»Rappel de notions de base
Animaux diploide : (chromosome paternel et maternel) AEMutant hétérozygote (+/-) ÅAEhomozygote (-/-) mutation récessiveAEphénotype normal (hétérozygotes) (majorité : "perte de fonction») mutation dominanteAEphénotype anormal (het.) mutation semidominanteAEphénotype observable (het.) + phénotype anormal (hom.) (minorité; haploinsuffisance, perte de fonction 50% -> anomalie) (Majorité des gènes) (minorité de gènes)Transmission des caractères à la
descendance (lois de Mendel)Dans le cas de mutations:
Généralement : mutations récessives
Pas de phénotype au niveau de F2
Mutations semi-dominantes ("haploinsuffisance») Phénotype muté dans 50% de F2 (hétérozyg.)Mutations dominantes : 50% au niveau de F2
(mutation "gain de fonction» et transgéniques) F1 F2 F3 A: Identification de mutations récessives affectant le développement : génétique "directe»AEIdentification de milliers de mutants (1996)
(Stratégie similaire pour la drosophile et C. elegans) Prix Nobel 1995: Nusslein-Volhard, Wieschaus & LewisAEAnalyse du phénotype.
AEIdentification du gène muté
(si mutation induite par insertion de transposons ou rétrovirus: AE si mutation ponctuelle induite par un mutagène :AEcartographie par utilisation de marqueurs
polymorphiques AE marqueur polymorphique proche de la mutation : "mapcross» Souche Tu (mutante)Autre souche (WIK, non mutée) Identification des mutations par séquençage à haut débit AE- "mapcross» :Exemple :
Chr. 20 portant la
mutation X : DNA souche Tu : DNA souche WIKRégion homozygote portant la mutation
AESNP» affectant un gène
B: Etude de la fonction des gènes par
"génétique inverse» Gène identifié (cloné) AEQuel est sa fonction ?AEmodification -de son expression
-de son activité et analyse du phénotypeTests de "Perte de fonction»
A)par délétion/mutation ciblée du gène ("knock-out»)AEinactivation complète du gène
B) par diminution de son expression
("knock-down»)AEinactivation -partielle
-(presque) complèteTests de "Gain de fonction»
C) par surexpression ou expression ectopique
A) La technique de délétion de gène ("Knock-out»)1)Construction du gène invalidé
(par clonage en bactéries)(B)2)Introduction dans les cellules
ES (cellules totipotentes) (A)
(par transfection ) et recombinaison homologue3)Implantation des cellules ES
dans les blastocystes4)Sélection des chimères
5)Identification des animaux
hétérozygotes6)Génération des homozygotes
Fig. 4.20 p 96 Scott Gilbert
(Prix Nobel à Cappechi, Evans et Smithies pourLa technique de Knock-out chez la souris)
"knock-out conditionnel ouà différents stades de développement AE
Invalidation du gène -dans un tissus
1)2)Expression de la recombinase CRE (croisement
avec souris transgénique exprimant CRE)Remarque :
Technique de "knock-out» par recombinaison
homologue :uniquement modèle souris Cause : pas de lignées cellulaires ES pour les autres modèles colonisant la lignée germinale jusque 2012 Mutagenèse ciblée de gène par les nucléases "Zinc finger Nucleases»,TALEN et CRISPR (From Streptotocus pyogenes)CRISPR/Cas9 (2012) (2011)(2008) Fok1Le domaine en doigt de
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