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IGNEMENT SUPERIEUR

UNIVERSITE DE LA MANOUBA

INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET (ISBST)

SUPPORT DE COURS

GENETIQUE MOLECULAIRE

UE : Enzymologie/ Génétique Moléculaire

Licence Fondamentale en Sciences du vivant, Parcours : Biologie intégrative : animale, végétale et microbienne

Niveau LF2

Elaboré par :

Dr. KHOUAJA Fattouma

Année Universitaire 2019/2020

2

Annexe 17

: Enzymologie/ Génétique Moléculaire

Code UE

Code ECUE

Plan du Cours Génétique Moléculaire

Introduction

Chapitre 1: La définition du gène

- Relation gène-enzyme - La complémentation fonctionnelle

Chapitre 2: Les mutations

- Propriétés des mutations - Notion de mutation germinale et de mutation somatique * Agents physiques * Agents chimiques - Les différents types de mutations et leurs conséquences * Substitution * Insertion/délétion/duplication * Mutations de Répétition (microsatellites et VNTR) * Transposition Chapitre 3: La réversion et la suppression intra et extracistronique

Chapitre 4: Génomes extra-chromosomiques

- Diversité des génomes mitochondriaux - Génomes chloroplastiques - Fluidité des génomes et évolution des séquences - Les mutations de structure - Les mutations de régulation

Travaux Pratiques et dirigés

- Test de complémentation et test de recombinaison - Suppressions intra et extra cistronique 3

Figure 1 : Structure de la molĠcule d'ADN

MolĠcule d'ADN :

double hélice

1 gène : fragment

d'ADN dĠterminant un caractère héréditaire

Bases azotées

Sucre + phosphate

1 gène

4 Figure 2 ͗ UniǀersalitĠ et ǀariabilitĠ de la structure de l'ADN

Figure 19 : Structure d'un microsatellite

5 Figure 4 : Mécanisme de la réplication semi-conserǀatrice de l'ADN 6 7

Figure 5 : SchĠma reprĠsentant la transcription de l'ADN et la maturation du transcrit primaire

chez les eucaryotes. Figure 6 : La traduction chez les procaryotes (a) et les eucaryotes (b). 8

Acide aminé Abréviation Nature chimique

Alanine : Ala A Aliphatique

Arginine : Arg R Basique

Asparagine : Asn N Amide

Acide aspartique : Asp D Acide

Cystéine : Cys C Soufré

Acide glutamique : Glu E Acide

Glutamine : Gln Q Amide

Glycine : Gly G Aliphatique

Histidine : His H Basique

Isoleucine : Ile I Aliphatique

Leucine : Leu L Aliphatique

Lysine : Lys K Basique

Méthionine : Met M Soufré

Phénylalanine : Phe F Aromatique

Proline : P P Imine

Sérine : Ser S Hydroxylé

Thréonine : Thr T Hydroxylé

Tryptophane : Trp W Aromatique

Tyrosine : Tyr Y Aromatique

Valine : V V Aromatique

Tableau I : Nomenclature et nature chimique des acides aminés

Tableau II : Code génétique

9 Figure 7 ͗ RĠparation de l'ADN par recombinaison 5 5 Figure 9 : Les possibilitĠs d'appariement pour le 5-BU un atome de Br en C5 à la place de CH3. remplace en s'appariant aǀec A passer une partie de son edžistence dans sa forme ionisĠe rare). Dans cet Ġtat, il s'apparie avec la G, imitant le comportement de la C et induisant donc des mutations lors de la réplication.

Figure 8 : Appariement normal Tymine -Adénine

(a) (b) (céto) 10 Figure 10 ͗ Les possibilitĠs d'appariement pour le 2-AP (a)Normalement, il s'apparie aǀec T (b)Dans son Ġtat protonĠ, il peut s'apparier aǀec la C. (a) (b) Figure 11 : Désamination oxydative de C en U sous l'action de l'acide nitreudž HNO2 responsable de la transition de GC en TA. En gris ͗ les nuclĠotides de l'ADN initial, entre parenthğses une molĠcule d'ADN normale. HNO2 HNO2 Figure 12 : Désamination oxydative de A en H (hypodžantine) sous l'action de l'acide nitreudž

HNO2 responsable de la transition de TA en GC.

En gris ͗ les nuclĠotides de l'ADN initial, entre parenthğses une molĠcule d'ADN normale. Figure 13 : le mésappariement spécifique induit par l'alkylation. L'alkylation (dans ce cas, l'Ġthylation due ă l'EMS) de la position O-6 de la G, ainsi que la position O-

4 de la T, peut conduire à un mésappariement

respectivement avec la T et la G. chez les bactéries où les mutations ont été analysées plus en détail, les principales mutations détectées sont des transitions GC sensible à la mutagénèse.

Figure 14 : Alkylation du G par le NG

(Nitrosoguanidine) générant le O6-méthylguanine qui NG

O6-méthylguanine

11

Figure 15 : Edžemples d'agents intercalants.

(a) la structure des agents usuels proflavine, acridine orange et ICR-191.

(b) Un agent intercalant se glisse entre les bases azotées empilĠes dans la molĠcule d'ADN. Cet

Ġǀğnement peut conduire ă des additions et soustraction d'une seule paire de nuclĠotides.

Figure 16 : Structure du BET

Figure 17 : Structure d'un dimğre de thymine.

(Seules les bases sont représentées) -Anomalies de méthylation -Anomalies de remodelage chromatinien Exemple : Syndrome ICF (immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies) : méthylase Exemple : Syndrome de Beckwith-Wiedemann PraderWilli Angelman 9 10

Réversions

- Réversion vraie AAA (Lys) [+] directe GAA (Glu) [m] réversion AAA (Lys) [+] - Réversion équivalente UCC (Ser) [+] directe UGC (Cys) [m] réversion AGC (Ser) [+]

CGC (Arg, basique) [+] directe CCC (Pro, non basique) [m] réversion CAC (His, basique) [pseudo-

sauvage]

Mutations suppressives intragéniques

- Décalage du cadre de lecture en sens opposé en un second site dans le même gène

CAT CAT CAT CAT CAT CAT

CAT XCA TAT CAT CAT CAT

- Mutation faux-sens en un second site Une 2ème déformation physique qui restaure une confrontation protéique de type plus ou moins sauvage après

une 1ère déformation.

Mutations suppressives extragéniques

- Suppressives de non-sens onnel dans la région de son anticodon qui lui permet de reconnaître un codon non- lui, pour insérer un AA (tyrosine), ce qui permet la poursuite de la traduction. - Suppressives de faux-sens GénéralemenE. coli possède un suppresseur de faux- mal traduits, les mutations observées ne sont pas létales, sans doute à cause de la faible efficacité de la substitution anormale.

- Suppressives de décalage du cadre de lecture Les exemples sont très rares. Dans un cas, un anticodon de 4 nucléotides appartenant à un ARNt unique peut

- Suppressives par changement des conditions physiologiques Un défaut dans une voie biochimique est compensé par une autre mutation (exemple : une mutation qui

ère mutation).

L'addition de bases change

de cadre de lecture la délétion de base restaure le cadre de lecture correct

Tableau VII : Les mutations suppressives et leurs conséquences fonctionnelles au niveau protéique

37
Figure 20 : Empreinte génétique par analyse de polymorphisme microsatellite Figure 21 : VNTR : régions hypervariable entre individus Figure 22 : Mutation des génomes par les transposons Pour réaliser leur cycle de multiplication, les transposons sont bordés par deux séquences

répétées et inversées ITR (Inverted Terminal repeat) et possèdent au moins un gène codant pour

de la séquence du transposon dans le génome). 38
Tableau IV : Nomenclature pour la description des mutations et autres variations de séquence

1- Indication de la séquence référence:

2- Code:

substitution (pour les bases) >

étendue -

autres changements sur ; autres transcrits/mosaïque , incertain () allèle [ ] délétion del duplication dup insertion ins inversion inv conversion con extension ext codon stop X décalage du cadre de lecture fsX brin opposé o translocation t

3- Type de variation/mutation:

Substitution

c.123A>G sur le cDNA, A, en position 123, est remplacé par G p.P252R sur la proteine, proline (P) remplacée par arginine (R)

Délétion

c.546delT délétion de T en 546 c.586_591del six bases délétées p.F508del délétion de phenylalanine (F) en 508

Duplication

c.546dupT duplication de T en 546 c.586_591dup duplication du segment 586 -> 591 p.G4_Q6dup duplication du segment à partir de glycine (G) en 4 jusqu' à glutamine (Q) en 6

Insertion

c.546_547insT insertion de T entre 546 et 547 c.1086_1087insGCGTGA insertion de GCGTGA p.K2_L3insQS insertion de glutamine sérine entre lysine (K) en 2 et leucine (L) en 3

ADN codant c.

ADN génomique g.

ADN mitochondrial m.

ARN r.

Protéine p.

39

Tableau IV (suite) : Nomenclature pour la description des mutations et autres variations de séquence

Inversion

c.546_2031inv segment 546 -> 2031 inversé

Décalage cadre de lecture

p.R83SfsX15 arginine (R) est le premier acide aminé changé, c' est en position 83, cela donne une sérine (S) à la place, la taille du segment en aval est de 15, codon stop (X) inclu

Bases de données

40

Résumé : Les mutations

I-

1- Distinction mutations perte de fonction / mutations gain de fonction :

La modif : une

- soit une mutation de perte de fonction , par effet quantitatif (sous-expression conduisant à moins ou pas

de produit du gène) ou par effet qualitatif (un produit moins actif, voire inactif),

- soit une mutation de gain de fonction, par effet quantitatif (sur-expression conduisant à plus de produit

du gène) ou par effet qualitatif (un prod propriété physico-

2- Distinction mutations ponctuelles / mutations non ponctuelles :

a- La mutation pon

modifiée en ...CG... par délétion de la paire de base centrale, ou modifiée en ...CACG... par insertion

re les deux premières. b-

mutations chromosomiques par CO (méiotique ou mitotique ou interphasique), soit à des insertions, notamment

de séquences rétrovi

répétée, en général un triplet. Dans les deux premiers cas, elles conduisent principalement à des pertes de fonction

t souvent de gain de fonction, notamment quand le triplet répété est dans une séquence codante (maladie à triplet du type maladie de Huntington).

3- Les différents types de mutations ponctuelles du gène

a- Une mutation affectant le promoteur ne change nullement la séquence codante du gène et par conséquent la

chaîne polypeptidique spécifiée par ce gène. Mais une telle mutation peut modifier profondément le message

n et " promoteurs

gène soit sous ou sur transcris peut avoir des conséquence extrêmes. Il suffit de rappeler que la plupart des

ou plusieurs gènes, notamment des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. 41
b- Mutation affectant le site de polyadénylation. c- Mutations dans les séquences transcrites et non traduites mytonique)

e- Les mutations de la séquence codante auront des effets très variés dépendant là encore de la nature de la

mutation et de son site dans la séquence codante: * une mutation STOP t STOP, UAA ou UAG

libère une chaîne tronquée qui a peu de chance de prendre une conformation tri-dimensionnelle correcte et

active; les mutations STOP sont presque toujours des mutations de perte de fonction.

de bases. Comme la lecture par le ribosome se fait par triplets contigus, tous les triplets sont modifiés en aval

; de plus le décalage du cadre de lecture

introduit généralement très vite un codon stop. Sauf cas exceptionnels, les mutation de décalage sont des

mutations de perte de fonction.

Mutation de la séquence du promoteur :

effet quantitatif de sous-expression (perte de fonction) ou de surexpression (gain de fonction)

Mutation de la séquence de

polyadénylation: effet quantitatif de sous expression (perte de fonction) le plus souvent effet quantitatif de sous-expression (perte de fonction)

Mutation d'Ġpissage :

conduisant ă l'absence d'edžcision ou une excision anormale : perte de fonction, sauf exceptions.

Mutations dans la séquence codante :

- mutation STOP (non-sens) : perte de fonction, sauf exception, par arrêt prématuré de la traduction, - mutation Faux-sens ͗ substitution d'un aa par un autre aa : selon les cas perte ou gain de fonction, - mutation de décalage du cadre de lecture par dĠlĠtion ou insertion d'une ou deudž paires de bases : perte de fonction sauf exception, - suppression ou addition d'un aa par dĠletion ou insertion de trois paires de bases : selon les cas perte ou gain de fonction. perte ou gain de fonction, selon les cas. promoteur terminateur 5'UTR 3'UTR 42
* une mutation faux sens nouveau c

conformation de la protéine et dans son activité. Selon les cas, la substitution peut être sans effet (on parlera alors

de polymorphisme plutôt que de mutation faux sens), ou avoir un effet, en rendant la protéine plus active ou

chaîne peptidique une propriété ou une activité nouvelle et constituer alors un véritable " gain de fonction ».

Remarque:

la fonction du gène muté est modifiée, la fonction antérieure peut être conservée si ce gène existait préalablement en deux

copies identiques, ce qui est possible car il existe un mécanisme, le crossing-over inégal, par lequel un gène peut se trouver

et conduisant à la synthèse sans risque de faire perdre la fonction du gène qui reste assurée par la copie non mutée.

4- rs conséquences:

a- Les triplets répétés:

taille (le nombre de répétitions du triplet), bien que stable à la réplication, peut parfois subir des variations; au

une

est dominant dans toutes les maladies dites " à triplets » exceptée la maladie de Friedrich, le cas des maladies

sexe féminin. (maladie de Huntington, ataxies spino- domaine poly--m (dystrophie myotonique: effet

du gène par blocage de la transcription, ce qui explique le caractère récessif de son effet). Les " maladies à

triplets » sont détaillées dans le tableau plus loin. Ces mutations sont des mutations " dynamiques ». b- , comme les rétrovirus, peuvent inactiver un gène ou déréguler son expression selon leur dans le tissu hépatique infecté. c-Les macromutations - over conduisant, selon les -over

inégal), et aux diverses anomalies de structures des chromosomes (translocations, inversions, déletions,

duplication, fusions centriques). 43

Les maladies à triplets

1- Localisation, taille normale, prémutée (intermédiaire) et pathologique des triplets répétés:

maladie localisation triplet taille normale taille prémutée taille pathogène effet pathologique X-fragile CGG 6-52 59-230 230-2000 inactivation du gène par hyperméthylation induite du promoteur et absence de transcription

Maladie de Huntington séquence

codante

CAG 10-34 36-39 40-121

domaine poly-glutamine

Ataxie spinocérebelleuse

type 1: SCA1 séquence codante

CAG 6-39 40-81 expansion

domaine poly-glutamine

SCA2 séquence

codante

CAG 14-31 34-59

domaine poly-glutamine SCA3 (Machado-Joseph) séquence codante

CAG 13-44 60-84

domaine poly-glutamine

SCA6 séquence

codante

CAG 4-18 21-28

domaine poly-glutamine

SCA7 séquence

codante

CAG 7-17 38-130

domaine poly-glutamine

DRPLA séquence

codante

CAG 7-25 49-75

domaine poly-glutamine

Dystrophie myotonique séque

non codante

CTG 5-37 50-80 80-1000 interaction toxique avec

protéines de liaison aux messagers

Ataxie de Freidrich séquence

intronique

GAA 6-29 34-40 200-900 bloque la transcription

(effet récessif)

2- Anticipati-rubro-pallido-luysienne (DRPLA) :

âge de début: 60

ans

âge de début: 60

ans

âge de début: 20

ans

âge de début: 7 ans

taille du CAG: 65 44

Figure 23 : Protocole suiǀi par Beadle Θ Tatum (1940) pour la crĠation de simples mutants d'audžotrophie chez

le champignon Neurospora L'addition d'arginine au milieu minimum restaure la croissance chez un mutant arg-

Sur un même mycélium se différencient des organes mâles = conidies et des organes femelles = ascogone. Si le

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