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observant le gain génétique des indices nationaux et des caractères entre les deux indices est de 96 % la sélection en fonction de l'IPV menait.
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Définir les approches expérimentales gain et perte de fonction d'un gène ; appliquer ces définitions pour interpréter des exemples d'expériences – Mammifères :
Quels sont les trois types de mutations ?
Il est possible de distinguer 3 grandes classes de mutations : les substitutions nucléotidiques, les insertions/délétions de quelques nucléotides et les remaniements géniques de grande taille.Quelles sont les conséquences d'une modification génétique ?
Une modification génétique sur un humain aurait des conséquences sur toute sa descendance. De plus, des dérives pourraient avoir lieu pour améliorer l'esp?, acte incompatible avec l'éthique scientifique. Malgré ces avertissements, les premiers bébés génétiquement modifiés sont nés en novembre dernier, en Chine.Comment faire un Knock-out ?
La technique d'invalidation d'un gène se base sur la recombinaison homologue : on peut ainsi remplacer le gène complet, présent dans le génome de l'organisme, par une version suffisamment incomplète du gène pour qu'il ne s'exprime pas, ou par un autre gène (ce qui permet de suivre l'expression du gène invalidé).- Les étapes du processus de génie génétique sont les suivantes (1) isoler le gène d'intérêt, (2) le couper dans la molécule d'ADN, (3) l'insérer dans un vecteur, (4) introduire le vecteur dans une cellule hôte, et (5) sélectionner les cellules qui ont absorbé le vecteur.
Plan du cours "Biologie du
développement»Partie I : Notions de base de la biologie du
développement. Les facteurs moléculaires contrôlant les processus de base : différenciation et communication cellulaire ,morphogenèse gènes.Partie 2 : Le développement du xénope et du
zebrafish: Le Xénope : gènes et facteurs régulateurs impliqués durant les premiers stades Le zebrafish ou poisson-zèbre : gènes et facteurs régulateurs .Le "remodelage» du mésoderme (somitogenèse, formationLe "remodelage
Les techniques utilisées en
biologie du développement -au niveau de la protéine2) Etude de la fonction des gènes
AEApproches génétiques
mutation de gènes -par mutagenèse aléatoire (génétique classique ou "directe») -par mutagenèse ciblée (Génétique inverse) inactivation ou surexpression cibléeGénétique "directe»
GENE fonction (phénotype)Génétique inverse
AEEtude de la fonction des gènes
3) Embryologie expérimentale:
Etude des cellules et tissus par :
-Transplantations et explants -Marquages cellulaires1) Par RT-PCR
-Extraction de RNA de différents tissus -Réverse Transcription -Analyse des fragments par electrophorèse sur gel AE de développementN.B. :
-très sensible (Requiert peu de tissu) -localisationApproximative
-Nbre limité de gènes étudiés (-quantitatif siPCR en temps
réel)3) "Micropuces» (Microarrays)
(totalité des gènes)AEComparaison de
2échantillons
Par exemple:
-2 tissus différents -1 tissus à 2 stades -1 tissus +/-traitement -WT ÅAEmutéDésavantage :
-Pas de localisation précise3 bis : RNA-seq
Séquençage à haut débit des cDNA (AE50-100 millions de seq.) Exemple : RNA-seq de cellules beta pancréatiquesAvantages :
-très sensible -Applicable à des génomes non séquencés (non annotés) AEdécouverte de nouveaux transcripts AEHlxb9 est exprimé dans les cellules beta et pas le gène Arx4) Par hybridation in situ sur embryons entiers
Sondes :
ARN complémentaires
(Radioactif) ou lié à un épitope (digoxigénine ou fluorescéine) de zebrafish entier SOX4b AE Désavantage : nombre limité de gènes étudiés PTF1aCel. Crêtes neurales
pancréasCerveau postérieur
pancréas (pour gros embryons opaques)AELocalisation
précise dansExemple:
Expression du gène SOX4 dans le pancréas et
e16 : 16 ième jour embryonnaire)AEImmunohistochimie ou immunofluorescence
AbN°1 AEProtéine
AbN°2 (anti-IgG souris)
-couplé à un fluorophore (FITC, TexasRed -couplé à une Enzyme (Alkaline Phosphatase ) AEreactionExemple
-noir : ARNm sox4 (révélé par hybridation in situ) -vert :Ab anti-insuline (+ anti IgG-lapin-FITC), -rouge : Ab-glucagon (+ anti-IgG-souris-TexasRed) glu ins AELocalisation précise de la protéine dans le tissuARNm sox4
N.B.: Nécessite un anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine étudiée.2) Etude de la fonction des gènes.
A)approches génétiques.
AEmutation ou délétionde gènes
Rappel de notions de base
-Mutations induites ou spontanées. -mutations ponctuelles (substitutions ou "frame shift»)(mutagènes chimiques, exemple ENU) transposon ou retrovirus )A) pertes de fonction
-complète ("null») -partielles (hypomorphe)AEsérie allélique
B) Gain de fonction
(activation constitutive du produit du gène)AEmutation dominante
WTHypomorphes
"null»Rappel de notions de base
Animaux diploide : (chromosome paternel et maternel) AEMutant hétérozygote (+/-) ÅAEhomozygote (-/-) mutation récessiveAEphénotype normal (hétérozygotes) (majorité : "perte de fonction») mutation dominanteAEphénotype anormal (het.) mutation semidominanteAEphénotype observable (het.) + phénotype anormal (hom.) (minorité; haploinsuffisance, perte de fonction 50% -> anomalie) (Majorité des gènes) (minorité de gènes)Transmission des caractères à la
descendance (lois de Mendel)Dans le cas de mutations:
Généralement : mutations récessives
Pas de phénotype au niveau de F2
Mutations semi-dominantes ("haploinsuffisance») Phénotype muté dans 50% de F2 (hétérozyg.)Mutations dominantes : 50% au niveau de F2
(mutation "gain de fonction» et transgéniques) F1 F2 F3 A: Identification de mutations récessives affectant le développement : génétique "directe»AEIdentification de milliers de mutants (1996)
(Stratégie similaire pour la drosophile et C. elegans) Prix Nobel 1995: Nusslein-Volhard, Wieschaus & LewisAEAnalyse du phénotype.
AEIdentification du gène muté
(si mutation induite par insertion de transposons ou rétrovirus: AE si mutation ponctuelle induite par un mutagène :AEcartographie par utilisation de marqueurs
polymorphiques AE marqueur polymorphique proche de la mutation : "mapcross» Souche Tu (mutante)Autre souche (WIK, non mutée) Identification des mutations par séquençage à haut débit AE- "mapcross» :Exemple :
Chr. 20 portant la
mutation X : DNA souche Tu : DNA souche WIKRégion homozygote portant la mutation
AESNP» affectant un gène
B: Etude de la fonction des gènes par
"génétique inverse» Gène identifié (cloné) AEQuel est sa fonction ?AEmodification -de son expression
-de son activité et analyse du phénotypeTests de "Perte de fonction»
A)par délétion/mutation ciblée du gène ("knock-out»)AEinactivation complète du gène
B) par diminution de son expression
("knock-down»)AEinactivation -partielle
-(presque) complèteTests de "Gain de fonction»
C) par surexpression ou expression ectopique
A) La technique de délétion de gène ("Knock-out»)1)Construction du gène invalidé
(par clonage en bactéries)(B)2)Introduction dans les cellules
ES (cellules totipotentes) (A)
(par transfection ) et recombinaison homologue3)Implantation des cellules ES
dans les blastocystes4)Sélection des chimères
5)Identification des animaux
hétérozygotes6)Génération des homozygotes
Fig. 4.20 p 96 Scott Gilbert
(Prix Nobel à Cappechi, Evans et Smithies pourLa technique de Knock-out chez la souris)
"knock-out conditionnel ouà différents stades de développement AE
Invalidation du gène -dans un tissus
1)2)Expression de la recombinase CRE (croisement
avec souris transgénique exprimant CRE)Remarque :
Technique de "knock-out» par recombinaison
homologue :uniquement modèle souris Cause : pas de lignées cellulaires ES pour les autres modèles colonisant la lignée germinale jusque 2012 Mutagenèse ciblée de gène par les nucléases "Zinc finger Nucleases»,TALEN et CRISPR (From Streptotocus pyogenes)CRISPR/Cas9 (2012) (2011)(2008) Fok1Le domaine en doigt de
zincLes protéines TAL
Protéines de Xanthomonas
gènes de la plante infectéeLa structure 3D des
protéines TALLes nucléases TALEN
Le système CRISPR/Cas
Système immunitaire bactérien permettant la
Le système CRISPR/Cas9 : 1 protéine et 1 ARN guideT7promoterT7promoter
T7 RNA polymerase
Oligonucleotide (20 nucl.)
Cloning
gRNA plasmidEfficiency of
Mutagenesis :
BsaIBsaI
(+NGG in the endogenous gene)Mutagenèse ciblée par les nucléases
CRISPR/Cas9 ou TALEN
2) Injection des
-gRNA -Cas9 mRNA (3-4 months) 1 day3-4 months
1)4) Vérification de la
transmission de mutation5) Identification des
heterozygotes AE Ou -Paire de TALEN Ou2) Etude de la fonction des gènes
("Knock-down»)En exprimant ou en injectant :
-des ARN antisens -des oligonucléotides antisens (morpholinos) AE -des ARN double brin ("RNA interference») AE P 103C-term
atgHMG box mo1sox4b C- term atgHMG box mo2sox4bExemple : Fonction du gène Sox4b dans la
différenciation des cellules pancréatiques chez le zebrafishA : stéréomicroscope
B : injecteur
C : micromanipulateur
3) Etude de la fonction des gènes
par surexpression (gain de fonction) -xénopeet zebrafish) -Par transgenèse AEsurexpression, expression ectopique (gène modifié)Gène étudiéPromoteur
1) Construction du transgène
2) Injection du transgène dans le zygote
(intégration au hasard dans le génome) analyse de son phénotype24 hpf4 hpf
( pour les gènes impliqués dans les premières phases du développement) (cDNA)P0-Pax6b:GFP
AEDéduction des cascades
régulatrices par tests de gain et de perte de fonction NodalBon Fau/Gata5 X
CasEndoderme
: nécessaire et suffisant : nécessaire et suffisant : nécessaire mais pas suffisant et Cas 1)2)Transplantations cellulaires
3)Marquage cellulaire:
-par injection de colorants ou fluorophores -(par marquage génétique)AEnotion de spécification et détermination
cellulaire AEAEnotion de lignage cellulaire et carte de destin
Différence entre destin, détermination et
spécification cellulaire.Marquage
cellulaireTransplantation
cellulaireExplantDestin
cellulaireDétermination
cellulaire spécificationCellulaire
(labile) "Carte de destin cellulaire » ("fate map») "Carte de spécification cellulaire »Centre
AELes cellules ne sont pas déterminées au stade blastula -Marquage cellulaire par injection de molécules fluorescentes (chez le xénope et zebrafish)AEétude du lignage cellulaire (3-5 jours)
(carte de destin ou "fate map») AELes cellules sont destinées (mais pas déterminées)quotesdbs_dbs41.pdfusesText_41[PDF] mutation délétère définition
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