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Immuno-

hématologie

Livret 4 d'activités technologiques

Chantal Muller (Professeur - Lycée La Martinière Duchère - LYON )A+

Remerciements

Mes remerciements vont à tous ceux qui ont permis la réalisation de cet ouvrage, en particulier

certaines de mes collègues, professeurs au lycée La Martinière Duchère de Lyon avec qui j'ai travaillé

avec énormément de plaisir en immuno-hématologie :

Stéphanie Darmochod et Caroline Platroz qui

m'ont aidé à améliorer ces fiches techniques ont réalisé de nombreux schémas (en particulier Stéphanie) et ont relu l'ensemble des livrets.

Un remerciement aussi à Christiane Robin,

technicienne de laboratoire au lycée La Martinière Duchère de Lyon, qui a contribué avec compétence et gentillesse à la mise au point de techniques. Des remerciements aussi pour Gilles et Sangeetha Muller qui m'ont aidé pour la mise en page.

Avant-propos

Ce livret 4 d'activités technologiques s'adresse aux étudiants de première année de section de

technicien supérieur d'analyses de biologie médicale (B1ABM).

Il correspond au module 4 des activités technologiques d'hématologie du référentiel 2008 du brevet de

technicien supérieur d'analyses de biologie médicale.

Ce livret 4 fait partie de quatre livrets relatifs aux enseignements technologiques d'hématologie de la

section technicien supérieur d'analyses de biologie médicale. Livret 1 - Cellules normales du sang et de la moelle rouge des os

Livret 2 - Hémopathies

Livret 3 - Hémostase

Livret 4 - Immuno-hématologie

MAIMAI 2012 2012

SommaireSommaire

Introduction à l'immuno-hématologie.........................................................................................................5

Chapitre 1 - Groupes sanguinsChapitre 1 - Groupes sanguins

Pré-requis et objectifs.................................................................................................................................

Détermination des groupes sanguins-Généralités .....................................................................................

Fiche 1 - Détermination des groupes sanguins du système ABO ............................................................

Fiche 2 - Exercices: groupage ABO ........................................................................................................

Fiche 3 - Recherche de la substance H dans la salive..............................................................................

Fiche 4 - Groupage Rhésus standard........................................................................................................

Fiche 5 - Phénotypage Rhésus complet....................................................................................................

Fiche 6 - Détermination du groupe érythrocytaire dans le système Kell..................................................

Fiche 7 - Phénotype étendu.......................................................................................................................7

8 11 18 21
23
31
37
41
Chapitre 2 - Anticorps irréguliersChapitre 2 - Anticorps irréguliers

Pré-requis et objectifs.................................................................................................................................

Fiche 1 - Recherches des anticorps irréguliers - Généralités ...................................................................

Fiche 2 - Test de Coombs indirect ...........................................................................................................

Fiche 3 - Test enzymatique à la papaïne...................................................................................................

Fiche 4 - Test de Coombs direct ...............................................................................................................

Fiche 5 - Procédure d'identification des anticorps irréguliers (AI) et exercices d'application..................

Fiche 6 - Titrage des anticorps irréguliers de type IgM.............................................................................

Fiche 7 - Titrage des anticorps irréguliers de type IgG.............................................................................43

44
51
57
61
65
75
77
Chapitre 3 - Techniques en gel filtrationChapitre 3 - Techniques en gel filtration

Fiche 1 - Groupage ABO - RH1...............................................................................................................

Fiche 2 - Exercices - Interprétations de résultats obtenus en minigel.....................................................79

81
83
Module 4 - Immuno-hématologieActivités technologiques Introduction à l'immuno-Introduction à l'immuno- hématologiehématologie1 - 1 - GénéralitésGénéralités L'immuno-hématologie correspond à l'étude : - des antigènes portés par les éléments figurés du sang - de l'immunisation qu'ils peuvent induire. - des pathologies qui en résultent. L'immuno-hématologie est donc une partie de la médecine commune à l'hématologie et à l'immunologie.

Elle concerne l'étude:

-des groupes sanguins -du système HLA -des Ac irréguliers (RAI) mis en cause dans les les incompatibilités foeto-maternelles, transfusionnelles -d'auto-Ac formés lors de pathologies auto-immunes ...

2 - 2 - Prélèvement sanguinPrélèvement sanguin

Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou sur citrate de sodium. Un prélèvement sur tube sec ne permettra pas la réalisation de tests automatisés. Les procédures qui concernent les groupes sanguins, et les examens immuno-hématologiques en

général, doivent être rigoureuses, en particulier pour ce qui concerne la prescription des examens et

l'identification des prélèvements. ATTENTION : Deux déterminations du groupe sanguin sont nécessaires pour obtenir une carte de groupe sanguin. La législation précise : deux prélèvements effectués à des moments différents.

Étiquetage des tubes :

L'étiquetage des tubes doit se faire :

➔par la personne qui a prélevé, ➔immédiatement après le prélèvement, ➔sur le lieu du prélèvement,

➔en contrôlant l'identité du patient et en la lui faisant décliner chaque fois que cela est possible.

Les contrôles doivent être particulièrement vigilants chez les sujets comateux et les nouveaux-nés.

L'étiquette doit comporter les informations suivantes: nom du patient, nom de jeune fille, prénoms,

sexe et date de naissance.

B1ABM CM ©5

Introduction à l'immuno-hématologie

Demande d'examen :

Toute demande comporte les mêmes informations que celles figurant sur l'étiquette ainsi que : ➔les noms du prescripteur et du préleveur, ➔la date et l'heure du prélèvement,

➔et selon les types d'examen, des renseignements complémentaires chaque fois qu'ils sont utiles à la

réalisation correcte de l'analyse et à son interprétation : antécédents d'anticorps anti-érythrocytaires, de

grossesse ou de transfusions, de réactions transfusionnelles.

Le prélèvement doit être stérile, de moins de 7 jours et conservé dans de bonnes conditions à + 4 °C.

Cependant il est souhaitable d'effectuer la détermination du groupe sanguin dès que possible après le

prélèvement. (en aucun cas une hémolyse ne doit être visible).

6CM ©B1ABM

Module 4 - Immuno-hématologieActivités technologiques - Chapitre 1 -- Chapitre 1 - Groupes sanguinsGroupes sanguinsPré-requis : -Système ABO et système H :  Structure des Ag érythrocytaires et tissulaires  Génétique  Propriétés des Ac plasmatiques  Règles de transfusion -Système Rhésus  Structure des Ag érythrocytaires  Génétique  Propriétés des Ac plasmatiques  Règles de transfusion -Système Kell  Structure des Ag érythrocytaires  Génétique  Propriétés des Ac plasmatiques  Règles de transfusion -Système MNS, Duffy, Kidd, Lewis, Luthéran...  Structure des Ag érythrocytaires  Génétique  Propriétés des Ac plasmatiques  Règles de transfusion -Réactions immunologiques d'agglutination -Propriétés antigéniques des anticorps •Objectifs : -Savoir réaliser les tests de groupages et phénotypages sanguins -Savoir valider les tests réalisés -Savoir interpréter les tests réalisés -Connaître les règles de la transfusion

B1ABM CM ©7

Introduction à l'immuno-hématologie

DDétermination des groupes sanguinsétermination des groupes sanguins

1 - 1 - Présentation générale des groupes sanguinsPrésentation générale des groupes sanguins

Un certain nombre d'antigènes (plus de 250 connus à ce jour codés par 29 systèmes) sont présents

sur les membranes des hématies humaines.

Ces antigènes sont codés par des gènes correspondants à des systèmes dont la connaissance est

nécessaire dans plusieurs domaines : transfusion sanguine, allo immunisation foeto-maternelle, transplantation ou études génétiques.

Ces antigènes :

- sont portés par des glycoprotéines et des glycolipides enchâssés dans la membrane des hématies et

dirigés vers l'extérieur de la cellule. - sont divisés en deux groupes :

1°) Le groupe appelé " ABO et ses associés » , pour lequel l'antigène est une glycoprotéine ou

glycolipide.

Les antigènes sont des polyosides et à ce titre ne peuvent être les produits directs de gènes, ceux-ci

ne sachant synthétiser que des protéines. Ils en sont donc le produit secondaire.

Les anticorps sont naturels (réguliers ou irréguliers), appartiennent à la classe des IgM, Ac froids

et complets.. Ils rarement acquis ou immuns (appartenant plutôt à la classe des IgG). Ce groupe est principalement composé de ABO, Hh, Lewis.

2°) Le groupe appelé " Rhésus (Rh) et ses associés » , dans lequel chaque molécule porte une

spécificité propre. Les antigènes sont des protéines, (donc produits primaires des gènes). Les anticorps ne sont pas naturels mais immuns ; ils ne sont présents que s'il a existé une

stimulation antigénique interhumaine (grossesse ou transfusion). Il appartient plutôt à la classe des

IgG, Ac chauds et incomplets.

Ce groupe est principalement composé de Rh, Kell, Duffy, Kidd, et MnSs.

2 - 2 - Principe des tests et validation techniquePrincipe des tests et validation technique

Les tests mis en oeuvre lors des groupages sanguins (ABO/RH) ou lors des phénotypages sanguins sont

tous basés sur des réactions d'agglutination active directe (si Ac=IgM) ou indirecte (si Ac=IgG).

La validation technique (ou analytique)du typage érythrocytaire repose sur : -des résultats conformes des témoins et des contrôles de qualités internes (CQI), -une absence de double population érythrocytaire. -un profil réactionnel cohérent, -une absence de discordance entre deux réalisations, -une absence de discordance avec des résultats antérieurs éventuels.

8CM ©B1ABM

Module 4 - Immuno-hématologieActivités technologiques

3 - 3 - Nomenclatures des principaux systèmes et antigènes deNomenclatures des principaux systèmes et antigènes de

groupes sanguinsgroupes sanguins

SystèmeSymbolePrincipaux antigènes

Appellation

couranteNomenclature internationale

ABOABOAABO1

BABO2

MNSMNSMMNS1

NMNS2 SMNS3 sMNS4

RhésusRHDRH1

CRH2 ERH3 cRH4 eRH5

KellKELKKEL1

kKEL2

DuffyFYFyaFY1

FybFY2

KiddJKJkaJK1

JkbJK2

LewisLeLeaLE1

LebLE2

LuthéranLuLuaLU1

LubLU2

B1ABM CM ©9

Introduction à l'immuno-hématologie

4 - 4 - Principe général des règles transfusionnellesPrincipe général des règles transfusionnelles

Avec les groupes ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MnS .. dont la connaissance assure la sécurité de la

très grande majorité des transfusions, il est illusoire de penser que la réalisation des transfusions est

" compatibles dans tous les systèmes ». La sécurité transfusionnelle repose sur le principe général suivant : Ne pas apporter, par les hématies transfusées :

- un antigène absent chez le receveur (pour éviter que le receveur ne s'immunise à la suite de ces

transfusions).

- un antigène spécifique d' un anticorps présent dans le sérum (plasma) du receveur (pour éviter une

réaction transfusionnelle liée à un conflit Antigène-Anticorps).

En savoir plus

Karl Landsteiner était un biologiste et médecin autrichien. Il a établit le premier classement des groupes sanguins, le groupe ABO. (1909)

10CM ©B1ABM

Module 4 - Immuno-hématologieActivités technologiques Chapitre 1 - Groupes sanguins - Fiche 1Chapitre 1 - Groupes sanguins - Fiche 1 étermination des groupes sanguins étermination des groupes sanguins du système ABO du système ABO DD1 - 1 - PrincipePrincipe

La détermination des groupes ABO est basée sur le principe général de la réaction d'agglutination

directe active.

AGGLUTINATION : réaction sérologique spécifique entre un Ag particulaire et un Ac aboutissant à la

formation d'un immuncomplexe formant un édifice multiparticulaire (appelé agglutinat) visible à l'oeil

nu ou à faible grossissement. ACTIVE : l'antigène fait partie intégrante de la particule DIRECTE : les anticorps intervenant sont des anticorps agglutinants (complets - IgM -) provoquant Cette détermination fait appel à deux épreuves : HUne épreuve globulaire (de BETH-VINCENT-TZANCK) correspondant à l'identification des Ag globulaires à l'aide d'anticorps connus (sérums tests). HUne épreuve sérique (de SIMONIN) correspondant à l'identification des Ac naturels à l'aide d'Ag connus (globules rouges tests). C'est la cohérence de ces 2 épreuves qui permet de conclure du groupe sanguin ABO.

B1ABM CM ©11

Chapitre 1 - Groupes sanguins - fiche 1

2 - 2 - MatérielMatériel

2.1 - 2.1 - Sang à testerSang à tester

Le sang est généralement prélevé sur EDTA ou éventuellement sur citrate de sodium..

2.2 - 2.2 - Sérums testsSérums tests

Sérums polvclonaux d'origine humaine provenant de donneurs sélectionnés (= allo-antisérum)

Anticorps monoclonaux d'origine murine (=hétéro-antisérum) :

Sérum test anti-A (coloration bleue)

Sérum test anti-B (coloration jaune)

Sérum test anti-A et anti-B (coloration naturelle du sérum) " Sérums » d'origine animale ou végétale (= hétérosérum) : Sérum ou solution test anti-H = sérum d'anguille (xénoantisérum) ou phytoagglutinine extraite de graines d'Ulex europaeus. Solution test anti-A1 = phytoagglutinine extraite de graines de Dolichos biflorus

2.3 - 2.3 - Hématies-tests (hématies étalons lavées et prêtes à l'emploi)Hématies-tests (hématies étalons lavées et prêtes à l'emploi)

Hématies étalons Al, (Rhésus -)

Hématies étalons A2, (Rhésus -) ne sont plus obligatoires

Hématies étalons B, (Rhésus -)

Hématies étalons 0, (Rhésus +)

Ce sont des hématies humaines prélevées sur anticoagulant. Elles ont été lavées 3 fois en sérum

physiologique puis remises en suspension dans une solution conservatrice.

Les concentrations des suspensions globulaires dépendent de la technique retenue et des indications

données par le fabricant pour chaque réactif

Techniques sur plaque 10% (V/V)

Techniques en tubes à hémolyse 5% (V/V)

Techniques en microtubes (ou microplaque)1 à 2 % (V/V)

2.4 - 2.4 - Petits matérielsPetits matériels

Plaque d'opaline et/ou plaque alvéolée à usage unique.

Pipettes Pasteur ou Psipettes

Agitateur en verre

Tubes de Khan et Portoir.

Centrifugeuse

12CM ©B1ABM

Module 4 - Immuno-hématologieActivités technologiques

3 - 3 - Mode opératoireMode opératoire

3.1 - 3.1 - Aspect législatifAspect législatif

Le groupage ABO doit être effectué dans des conditions très précises et rigoureuses. Le GBEA (Guide

de bonne exécution des analyses de biologie médicale) impose les conditions suivantes : La réalisation du groupage sanguin nécessite :

•une épreuve globulaire de Beth Vincent à recherche des Ag érythrocytaires A (ABO1) et B

(ABO2) avec les Ac monoclonaux anti-A (anti-ABO1) et anti-B (anti-ABO2) et anti-AB (anti- ABO3)

L'annexe D II précise que :

... Le réactif anti-B utilisé ne doit pas donner de réaction croisée vis-à-vis de l'antigène B acquis.

L'un des deux réactifs, anti- A ou anti-AB, doit pouvoir reconnaître les hématies Ax.

•une épreuve plasmatique de Simonin à recherche des Ac anti-A et Anti-B avec les hématies

tests A1 et B. Au moins une de ces hématies doit être de phénotype RH -1 Une détermination du groupe sanguin : deux définitions -1er cas : technique totalement automatisée (groupage + contrôles + enregistrement des

échantillons et des prescriptions):

à 1 détermination = 1 réalisation exécutée par un lot de réactif et un technicien -2ème cas : technique manuelle ou semi-automatisée :  1 détermination = 2 réalisations exécutées par 2 techniciens différents.

La saisie manuelle doit aussi être réalisée par une double saisie par 2 personnes différentes.

Un groupe sanguin valide doit être réalisé sur 2 prélèvements différents, à des temps réellement

différents, à raison d'une détermination par prélèvement.

3.2 - 3.2 - Préparation du sang à grouperPréparation du sang à grouper

B1ABM CM ©13BVpBVt

Sang N°Culot de GR

Plasma18 gouttes d'eau

physiologique5 gouttes d'eau physiologique2 gouttes de culot globulaire

Suspension à 10 %

Technique en

plaqueSuspension à 5 %

Technique en tube

S

Chapitre 1 - Groupes sanguins - fiche 1

3.3 - 3.3 - Technique sur plaque alvéoléeTechnique sur plaque alvéoléeRéalisation du groupage ABO : épreuve de Beth Vincent et épreuve de Simonin

Épreuve globulaire de Beth vincent

HDéposer une goutte des sérums tests anti-A, anti-B, anti-A+anti-B (et

éventuellement anti-H).

HDéposer une goutte de suspension globulaire à tester.

Épreuve globulaire de Simonin

HDéposer une goutte de suspension globulaire à A1, A2, B.

HDéposer 2 gouttes du sérum à tester.

Épreuve complémentaire : à effectuer uniquement si le test révèle un groupe A ou AB.

HDéposer une goutte des sérums tests anti-A1 et anti-H (ou anti-A1 uniquement si l'anti-quotesdbs_dbs1.pdfusesText_1

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