[PDF] Eléments transposables et analyse de la biodiversité végétale

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AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuvŽ par le jury de soutenance et mis ˆ disposition de l'ensemble de la communautŽ universitaire Žlargie. Il est soumis ˆ la propriŽtŽ intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de rŽfŽrencement lors de lÕutilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pŽnale.

Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine.fr

LIENS Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la PropriŽtŽ Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 Ecole doctorale RP2E (Ressources, Procédés, Produits, Environnement)

Collegium Sciences et Technologie

Thèse

DOCTEUR '

Mention " Ecotoxicologie, Biodiversité, Ecosystème » par Sarah CHUZEVILLE Caractérisation des fonctions codées par les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) intégrés dans un gène codant un ARNt lysine chez Streptococcus agalactiae :

Le 18 décembre 2012

Membres du jury :

Rapporteurs : M. Laurent MEREGHETTI, Professeur des Universités-Praticien hospitalier, Université François-

Rabelais, Tours

Présidente du jury de thèse :

Mme Nathalie LEBLOND, Professeur des Universités, Université de Lorraine, Nancy Examinateurs : Mme Alexandra GRUSS, Directrice de recherche, INRA, Jouy-en-Josas Mme Sophie PAYOT LACROIX, Chargée de recherche (HDR), INRA, Nancy, directeur de thèse M. Jean-Yves MADEC, Directeur de recherche, ANSES, Lyon, co-directeur de thèse 1

Unité Antibiorésistance et Virulence Bactériennes, ANSES, 31, Avenue Tony Garnier, 69362 Lyon Cedex 07,

2UMR1128 Génétique et Microbiologie, INRA-Université de Lorraine, Faculté des Sciences et Technologies,

Boulevard des Aiguillettes, BP 70239, 54506 Vandoeuvre-les-Nancy cedex.

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier en tout premier lieu Sophie Payot qui a dirigé de manière très avisée

cette thèse. Je la remercie indéfectible

et son aide ainsi que pour ses précieux conseils tout au long de ces trois années. Merci également de

dans le monde de la Recherche. Je remercie également Jean-Yves Madec qui a co- accueillie au sein de son unité e pour sa sympathie et ses encouragements. Un remerciement particulier va à Marisa Haenni qui a également participé fortement à cette thèse. Merci pour son soutien. Merci également pour sa disponibilité, son aide et sa gentillesse constante.

Merci à Pierre Leblond, Didier Calavas lli

e au sein de leurs laboratoires et fourni les moyens de réaliser cette thèse. Je tiens à remercier Laurent Mereghetti et Patrick Trieu-Cuot qui ont accepté de rapporter

également pour

leur participation au jury de thèse. Merci à Alexandra Gruss et Nathalie Leblond es à mon travail et de me faire Merci à Thierry Meylheuc (plateforme MIMA2 ) et Shaynoor Dramsi (Unité de Biologie des Bactéries Pathogènes à Gram positif

porté à mon travail par le biais de collaborations. Merci également à Jean-Baptiste Vincourt

(plateforme de protéomique de la Fédération de Recherche FR3209) pour son aide et sa réactivité.

Merci à Antibiorésistance et Virulence Bactériennes de Lyon ainsi que toutes

rendre ce travail agréable et qui se reconnaîtront. Merci pour leur accueil, leur sympathie, leur

soutien et leurs conseils. Je pense en particulier à Pierre pour sa bonne humeur, son aide et son soutien et à Florence euses discussions fructueuses.

Merci à

leur accueil et les échanges fructueux qui ont jalonné ce travail. Je remercie tous ceux sans qui cette

thèse ne serait pas ce qu'elle est : aussi bien par les discussions que j'ai eu la chance d'avoir avec eux

ou leurs contributions. Merci particulièrement à Aurore, Emilie, Janek, Max, Manu, Nico, PV et Romain pour

leurs conseils, leur aide, leur solidarité mais également de leur amitié si chère à mes yeux. Je tiens à

remercier particulièrement Nico pour sa précieuse contribution. Je tiens à remercier tout mes amis, proches et tous ceux qui se reconnaîtront qui de par leur

amitié, leurs encouragements et leur soutien ont également permis de rendre ce travail possible.

mes parents et à mon toutes les années durant et sans qui ce travail

été possible. Merci à vous !

Je pense aussi

épreuves.

Je pense aussi fortement à Floriane qui a été toujours présente dans les moments difficiles et

Je pense également, sans ordre particulier et sans que ceci ne soit une liste

exhaustive, à Corinne, Saliha, Kahina, Pierrick, Elizabeth, Yoan, Gaétan, Paméla, Heber, Cemile,

Carine, Yann, Franck, Natasha, Safia, Rawda, Séverine, Laëtitia, Pauline, Florent, Claire, Cyril,

Stéphane, Virginie (x2), Alban, Nathalie, Vahid, Julien, Loïc, Lauriane, Marine et Youssef.

Merci à tous !

SOMMAIRE

PREAMBULE 1

5 I. Eléments génétiques mobiles et apports de fonctions exogènes 7

1. Le transfert horizontal 7

1.2. Les mécanismes impliqués dans le transfert horizontal 9

1.2.1. La transformation 11

1.2.2. La transduction 11

1.2.3. La conjugaison 12

1.2.4. Les nanotubes 13

1.3. Les barrières au transfert horizontal 14

1.3.1. Les barrières liées au mécanisme de transfert 14

1.5. Les ICE, des partenaires incontournables du transfert horizontal 19

1.5.1. Caractéristiques des ICE, structure modulaire et dynamique évolutive 19

1.5.2. Mécanismes de transfert des ICE 20

2. Acquisition de nouvelles fonctions adaptatives par le transfert des ICE 24

2.1. Apport de nouvelles fonctions par les ICE: un phénomène de grande ampleur 24

2.2. Importance des échanges génétiques chez les streptocoques par le biais des ICE : exemples déjà

décrits 26

2.2.1. ICESt1 et ICESt3 de S. thermophilus 26

2.2.2. ICESde3396 de S. dysgalactiae subsp. equisimilis 27

2.2.3. Région de différence 2 (RD2) chez S. pyogenes 29

2.2.4. ICESe2 chez S. equi 31

2.2.6. ICESp2905 chez S. pyogenes 31

II. S. agalactiae ǣǯ 32

1. Streptococcus agalactiae 32

1.1. Généralités 32

1.2.1. Portage 34

1.2.2. Infections chez les nouveaux nés 35

1.2.3. Infections chez les adultes 36

1.3. S. agalactiae: une bactérie pathogène vétérinaire 36

1.5. Manifestations des infections au niveau cellulaire 38

2. Caractéristiques génomiques de S. agalactiae 39

2.2. Flexibilité du génome de S. agalactiae 41

2.3. Diversité des ICE chez S. agalactiae 43

III. Diversité des facteurs de virulence codés par le " core génome » de S. agalactiae. 47

1. Prévalence et régulation des facteurs de virulence 47

1.1. Diversité des facteurs de virulence 47

1.2. Pouvoir adaptatif de S. agalactiae 48

2.1. Propriétés adhésives de S. agalactiae 54

2.1.2. Un cas particulier : la formation de biofilm 58

2.2. Diversité des protéines de surface produites par S. agalactiae 63

2.2.1. Généralités 63

2.2.2. Antigènes I/II 65

2.2.3. Famille Alp 67

2.2.4. Pili 68

2.2.5. Famille des protéines à séquences répétées riches en sérine (protéines Srr) 69

2.2.6. Famille des protéines à séquences répétées riches en leucine (protéines LRR) 70

2.2.7. Protéines liant la fibronectine 70

2.2.9. Protéines liant le fibrinogène 71

2.2.10. Protéines liant le plasminogène 72

2.2.11. Protéines liant les immunoglobulines 73

2.2.12. Protéines liant les protéines du complément 74

2.2.13. Protéines liant les cellules de l'hôte 74

3. Le facteur CAMP : une hémolysine ubiquiste chez S. agalactiae 79

3.1. Composition de la paroi des érythrocytes mammifères 79

3.2. Action des sphingomyélinases sur la paroi des érythrocytes 79

3.3. Description et caractérisation de la réaction synergique hémolytique induite par S. aureus et

S. agalactiae 80

3.4. Des niches écologiques communes entre S. aureus et les streptocoques 81

3.5. Caractéristiques du facteur CAMP 81

3.6. Mécanistique du facteur CAMP 82

3.8. Le facteur CAMP, un facteur de virulence ? 85

Gram positive 86

3.9.1. Facteur Uberis 87

3.9.2. Facteur CAMP de S. pyogenes 88

3.9.3. Facteur CAMP de Propionibacterium acnes 89

3.9.4. Réaction CAMP chez Actinobacillus pleuropneumoniae 90

MATERIEL ET METHODES 97

I. Souches et conditions de croissance 99

II. Manipulations génétiques, biochimiques et de biologie moléculaire 104

1.1. ADN génomique 104

1.2. ADN plasmidique 105

2.1. PCR standards et séquençage 105

2.2. PCR long range et PCR nichées 106

4. Electroporation des bactéries 109

4.1. Electroporation des bactéries à coloration Gram négative 109

4.2. Electroporation des bactéries à coloration Gram positive 110

5. Stratégie développée pour la mutagénèse chez S. agalactiae 111

5.3. Mutagenèse chez S. agalactiae 113

6. Marquage des ICE et construction du transconjugant NEM316 (ICE_515_tRNALys). 116

7. Construction des plasmides pOri23-camp515 et pOri23-SAL_2056 117

8. Analyse des surnageants par SDS-PAGE 118

9. Spectrométrie de masse sur des surnageants précipités 119

III. Analyses phénotypiques 120

2. Test de résistance au stress oxydant 120

3. Analyse des propriétés antimicrobiennes 121

4.1. Test CAMP 121

4.2. Suivi hémolytique de la réaction synergique CAMP 122

5. Analyse des propriétés adhésives 123

5.1. Etude de la formation de biofilm sur polystyrène 123

5.3.1. Collecte de salive 125

6. Analyse statistique des données 127 RESULTATS 129

I. Analyse in silico des fonctions putatives portées par ICE_515_tRNALys 132

2. Réponse au stress oxydant 136

2.1. Protéine de type NRAMP 136

2.2. Glutarédoxine 137

3. Signalisation / compétition 138

4. Protéines de surface codées par ICE_515_tRNALys 140

4.1. Identification des protéines de surface in silico 140

4.2. Prévalence et fonctions de ces protéines chez les streptocoques 141

4.3. Domaines fonctionnels des protéines de surface codées par ICE_515_tRNALys. 143

5. Propriétés hémolytiques 147

II. ǯǯ 149

1. Analyse des régions promotrices 149

2. Analyse de la fonctionnalité des promoteurs 151

III. ǯ 153

1. Adaptation face à un stress oxydant 153

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