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I. Introduction

I.1 Méiose

La méiose est un processus essentiel pour toutes les espèces sexuées. Cette division cellulaire

spéciale permet de générer de la diversité par brassage génétique grâce à la recombinaison

méiotique qui correspond à un échange de matériel génétique entre chromosomes maternels et

paternels, appelés chromosomes homologues. Une connexion physique stable entre les chromosomes homologues au cours de la méiose, au sein d'une structure appelée bivalent, est indispensable à la bonne ségrégation des chromosomes homologues. Un défaut de formation

des bivalents au cours de la méiose aboutit en effet à une ségrégation des chromosomes non

équilibrée ; les gamètes ainsi formés ne contiennent alors pas le bon nombre de chromosomes ou

la bonne composition en chromosomes, ce qu'on appelle aneuploïdie et qui est à l'origine de stérilité.

La méiose est caractérisée par deux divisions successives (nommées méiose I et méiose II)

précédées d'un évènement unique de réplication, pendant lequel deux copies exactes de

chromosome homologue paternel et maternel sont créés (Figure 1). Ces copies sont appelées chromatides soeurs et elles sont connectées entre elles par les cohésines. La première division

méiotique est dite réductionnelle car elle permet la ségrégation des chromosomes homologues

parentaux. La méiose II est, quant à elle, équationnelle et se rapproche d'une mitose car elle

permet la séparation des chromatides soeurs. En conséquence, chaque cellule diploïde génère

quatre cellules haploïdes, contrairement à la mitose où le niveau de ploïdie est maintenu après

la division cellulaire pour assurer que les deux cellules filles présentent exactement le même contenu chromosomique que la cellule mère. 2

Figure 1: Méiose

Représentation schématique des deux divisions méiotiques d'une cellule diploïde présentant une paire de chromosomes homologues (2n=2). Le niveau de ploïd ie (n) et el contenu en ADN (C) sont indiqués pour

chacune des cellules. La réplication de l'ADN (Phase S) précède les divisions méiotiques. Au cours de la

méiose, deux étapes de ségrégation chromosomique génèrent quatre cellules haploïdes génétiquement

différentes. Au cours de la méiose I, les chromosomes homologues s'associent et échangent de

l'information génétique à travers la formation de chiasma, reflet cytologique des crossovers. Au cours de

la méiose II, les chromatides soeurs se séparent. 3

Figure 2: Perte de la cohésion

Au cours de la méiose la cohésion est perdue séquentiellement: dans un premier temps, la cohésion des bras est relâchée; dans un second temps, la cohésion centromérique est perdue. 4 Plusieurs mécanismes entrent en jeu pour séparer de manière correcte les homologues (Figure 3). Premièrement, la recombinaison homologue permet de connecter physiquement les chromosomes homologues l'un à l'autre. L'échange réciproque de matériel génétique (crossovers, CO) entre les chromatides soeurs de chaque homologue crée les connections physiques appelées chiasma. La structure qui résulte de cette association est appelée bivalent (Bishop & Zickler, 2004). Deuxièmement, la cohésion entre les chromatides soeurs doit

être finement contrôlée pour assurer la ségrégation des homologues. Les cohésines sont

éliminées de façon séquentielle pendant la division méiotique (Figure 2). En méiose I, la

cohésion au long des bras chromosomiques est éliminée, permettant la séparation des

chromosomes homologues. Ensuite, lors de la méiose II, la cohésion centromérique est éliminée,

permettant ainsi la ségrégation correcte des chromatides soeurs (Sakuno & Watanabe, 2009). Un autre élément indispensable à la bonne ségrégation des chromosomes homologues est l'orientation des kinétochores soeurs. Une orientation monopolaire en anaphase I est indispensable à la ségrégation correcte des homologues à des pôles opposés de la cellule ; alors

qu'en anaphase II, l'orientation des kinétochores soeurs devra être bipolaire pour permettre cette

fois la ségrégation des chromatides soeurs (Kleckner, 1996). I.2 Chronologie et aspects cytologiques de la prophase I de méiose La prophase I est l'étape la plus longue et la plus complexe de la méiose. La durée de la

prophase méiotique est bien supérieure à celle de la mitose et est très variable en fonction de

l'espèce. Par exemple, la prophase I chez la souris mâle dure 10 jours alors qu'elle ne dure que

33 heures chez Arabidopsis (Armstrong, Franklin, & Jones, 2003). C'est à cette étape qu'un grand

nombre d'événements tels que la compaction de la chromatine autour des axes, l'association entre les chromosomes homologues (mise en place du complexe synaptonémal) et la recombinaison homologue se réalisent (Zickler & Kleckner, 1998). 5 Figure 3: Connections entre chromosomes homologues

Les cellules méiotiques contiennent deux jeux de chromosomes, issus de chacun des parents (bleu et

orange): les chromosomes homologues. Après la réplication, chaque chromosome est compose d'une paire

de chromatides soeurs associées ensemble par des complexes cohésines (jaune). Les centromères "soeurs"

(cercle) se comportent comme une unité et se lient aux microtubules (lignes fines).

La prophase est divisée en 5

stades distincts : le leptotène, le zygotène, le pachytène, le diplotène et la diacinèse (Figure 4) (Wettstein, Rasmussen, & Holm, 1984; Zickler & Kleckner, 1999). Suite à la phase de réplication, les chromosomes sont composés de deux chromatides soeurs identiques maintenues ensemble par la cohésion. Au stade leptotène, les cassures double-brin se forment le long des chromosomes qui commencent à s'aligner. A ce stade, une structure protéique appelée élément axial se forme le long de chaque paire de chromatides soeurs pour former une structure continue (Figure 5). Lors du zygotène, les chromosomes homologues commencent à s'apparier, les éléments axiaux de chaque homologue s'assemblent pour former le complexe synaptonémal (Figure 6). En pachytène, le synapsis est complet entre les chromosomes homologues. La recombinaison méiotique s'achève par la réparation des cassures double brin conduisant, 6 entre autre, à la formation de crossing-over qui sont des échanges réciproques de matériel génétique. Figure 4: Représentation Schématique des cinq étapes de la prophase méiotique

Au cours du stade leptotène, l'élément axial (EA) se forme entre les chromatides soeurs. Au zygotène, les

EA de chaque paire d'homologue commencent à se "synapser" grâce à la polymérisation de l'élément

central du complexe synaptonémal (CS). Au pachytène, les chromosomes homologues sont synapsés sur

toute leur longueur. Le complexe synaptonémal se dépolymérise au diplotène et les chiasma apparaissent

en diacinèse.

Figure 5: L"élément axial (EA)

Représentation schématique des chromatides

soeurs au leptotène : elles forment des boucles ancrées à

l'axe. L'axe est constitué des protéines axiales. Les chromatides soeurs sont maintenues associées par les

cohésines. 7 En diplotène, le complexe synaptonémal se dépolymérise. En diacinèse, les chromosomes continuent leur condensation. Les chromosomes homologues sont facilement identifiables à ce stade et les chiasmata (manifestation cytologique des crossovers) sont identifiables. L'enveloppe nucléaire disparait en fin de diacinèse (Hamant, Ma, & Cande, 2006; Pawlowski & Cande, 2005). En métaphase I, les bivalents se placent et s'alignent sur la plaque métaphasique, chaque homologue étant capturé par des fibres de microtubules émanant des pôles opposées de la cellule. Les " kinétochores soeurs » (présents sur chaque chromatide soeur) sont mono- orientés. L'élimination de la cohésion le long des bras déclenche l'anaphase I. Les chromosomes homologues s'éloignent l'un de l'autre grâce à la traction exercée par le fuseau. Ils formeront deux lots de chromosomes à deux chromatides. En télophase I, le fuseau disparait, les chromosomes se décondensent et une nouvelle membrane nucléaire peut apparaître. A ce stade, la cytodiérèse n'est pas obligatoire.

Suite à cette première division, une seconde va être initiée sans phase de réplication

préalable. En méiose II, les chromosomes vont à nouveau se condenser. Lors de la métaphase II, ces chromosomes à deux chromatides vont s'aligner sur la plaque métaphasique et le fuseau de microtubules se forme à nouveau. Les kinétochores soeurs sont désormais bi-orientés permettant un accrochage bipolaire chromosomes. Ainsi chaque chromatide soeur est capturée par des fibres de microtubules et attirée vers les pôles opposés de la cellule après destruction de la cohésion encore présente au centromère. En fin d'anaphase II, quatre cellules haploïdes sont produites (Marston & Amon, 2004). 8

Figure 6: Formation du complexe synaptonemale

Représentation schématique de

la formation du complexe synaptonémal (CS). La formation du filament

transverse entre les éléments axiaux du CS permet la formation d'un CS mature. La formation du CS

commence en zygotène et est achevée en pachytène. 9

I.3 La recombinaison méiotique

La recombinaison

homologue méiotique (Figure 7) est initiée par des cassures double-brin programmées (CDB) de l'ADN qui se produisent en début de la méiose, en leptotène. Ces CDB font intervenir plusieurs protéines dont la protéine Spo11, acteur principal de la cassure (Keeney, Giroux, & Kleckner, 1997). Spo11 est l'homologue de la sous-unité VIA d'une topoisomérase d' archées (Bergerat et al., 1997). Une fois les CDB formées, commence une étape essentielle dite de " maturation » des

extrémités de l'ADN au niveau des CDB. La résection 5'-3' correspond à une dégradation

des extrémités de la CDB ayant pour conséquence la formation d'extrémités 3' simple-brin

de part et d'autre de la cassure. Ces extrémités sortantes pourront être prises en charge par

des recombinases, des protéines capables de diriger le brin invasif vers sa matrice de réparation. Deux étapes semblent participer à ce processus : le relargage de la protéine Spo11 qui est fixée de manière covalente aux extrémités 5' de part et d'autre du site de cassure, suivi d'une activité exonucléasique orientée 5'-3' qui va permettre de libérer les extrémités 3' simple-brin autour de la CDB (Borde, 2007; Garcia, Phelps, Gray, & Neale, 2011)

Deux recombinases ont été identifiées comme responsables de l'invasion des extrémités 3'

simple-brin, ou SEI (Single-End Invasion) ce qui conduit à former ce que l'on appelle la " D- loop». Il s'agit des protéines RAD51 et DMC1 qui sont apparentées à la protéine RecA d'Escherichia coli. Les deux protéines peuvent former des homopolymères capables de se fixer à un simple-brin d'ADN (Kagawa & Kurumizaka, 2010). La différence fondamentale entre les deux recombinases eucaryotes est que DMC1 est spécifique à la méiose alors que RAD51 est impliquée aussi bien dans les réactions de recombinaison méiotique que somatique (Bishop, Park, Xu, & Kleckner, 1992; Shinohara, Gasior, Ogawa, Kleckner, &

Bishop, 1997)

10

Figure 7: Modèle de réparation des CDB

D'après Allers et Lichten (2001). Dans ce modèle, l'intermédiaire de recombinaison de type " D-

loop » peut générer des NCOs ou des doubles jonctions de Holliday (dHJ) à partir desquels les

COs seront produits.

11

Les recombinases vont

se fixer à l'extrémité 3' simple-brin générée. L'ensemble ADN simple

brin et protéines associées est également appelé " filament présynaptique ». Le filament

présynaptique va être dirigé vers la région intacte du chromosome homologue qui servira de matrice de réparation. Cette invasion simple brin (ou

SEI pour Single-End Invasion) va

provoquer la formation d'un nouvel hétéroduplexe d'ADN entre l e filament présynaptique et le brin complémentaire de la molécule double-brin envahie. Cette étape de formation 2011)
Une fois la D-loop formée plusieurs voies permettent d'aboutir à la formation des CO (échanges réciproques de matériel génétique) et des non-CO (NCO) ou conversions géniques (échanges non réciproques) (Osman, Higgins, Sanchez-Moran, Armstrong, &

Franklin, 2011; Youds & Boulton, 2011)

. Deux groupes d'épistasie ont été distingués concernant les gènes impliqués dans la formation des CO, définissant deux voies de formation des CO; la voie de formation des CO de type I et la voie de formation des CO de

type II. En plus d'être différenciés par les gènes qui les contrôlent, les deux types de CO

présentent une différence de distribution. En effet, les CO de type I sont répartis de manière interférente; l'apparition d'un CO de type I inhibe l'apparition d'un autre CO de type I à

proximité. Ce phénomène de contrôle de distribution est appelé " interférence ». A l'opposé,

les CO de type II ne sont pas soumis à l'interférence. Il est intéressant de noter que la proportion d'apparition des CO de type I par rapport aux CO de type II varie selon les organismes. Chez

Arabidopsis

, S. cerevisiae et les mammifères, la majorité des CO sont formés via la voie des CO de type I (Libuda, Uzawa, Meyer, & Villeneuve, 2013; Lynn, Soucek, & ; Mercier et al., 2005; Youds & Boulton, 2011)

Des nombreux mécanismes de régulation de la recombinaison méiotique ont déjà été

décrits, mais ce sujet est encore très peu connu. Au cours de ma thèse, j'ai pu mettre en évidence une nouvelle voie de régulation de la recombinaison méiotique chez Arabidopsis. 12

II. Résultats

II. Les cycles d"assemblage et de désassemblage de ligases à domaines " cullin-RING » sont essentiels à la régulation de la recombinaison méiotique

Les eucaryotes

disposent d' un mécanisme très conservé de dégradation des protéines via la voie ubiquitin -proteasome. Dans ce système, une cascade de trois enzymes, E1, E2, et E3

activent et transfèrent des molécules d'ubiquitine (Ub) sur des protéines cibles. Une fois que

les protéines cibles sont ubiquitynilées, elles sont reconnues par le proteasome 26S, responsable de leur dégradation (Figure 8) (Haglund & Dikic, 2005; Hou & Yang, 2013;

Pickart, 2001)

. Ce sont les ligases à ubiquitine de type E3 qui sont responsables de la reconnaissance des protéines cibles. La classe la plus importante des ligases à ubiquitine de type E3 est celle des ligases à domaine cullin-RING (CRL) (Figure 9). L'activité des CRLs est

finement contrôlée par des cycles d'activation et de désactivation (Figure 10). Les CRLs sont

activées suite à leur assemblage, et désactivées suite à leur désassemblage. Les principaux

acteurs de cette régulation sont les voies de neddylation (aussi appelée rubylation), de deneddylation, et la séquestration des CRLs par la protéine CAND1 (CULLIN-associated

NEDD8-dissociated 1)

(Bosu & Kipreos, 2008). 13

Figure 8: la cascade de l"ubiquitylation

L'ubiquitine est tout

d'abord activée par l'enzyme E1 en présence d'ATP. L'ubiquitine est ensuite transférée de l'enzyme E1 à la cystéine du site actif de l'enzyme E2.

Enfin, l'enzyme E2 et l'ubiquitine se

lient à l'enzyme E3, permettant l'ubiquitylation des cibles reconnues par l'enzyme E3. Plusieurs cycles

d'ubiquitylation sont nécessaires à la formation d'une chaine de poly-ubiquitine sur les cibles, qui seront

ainsi reconnues par le protéasome 26S. 14 Figure 9: Composition d"un complexe CRL (Ligase à domaines " Cullin-RING ») Un complexe CRL est en général composé d'une protéine de type Culline jouant le rôle de plateforme,

d'une petite protéine à domaine RING (RBX1) et d'une ou plusieurs sous-unités (ici une protéine

" adaptatrice » et le récepteur du substrat).

Figure 10: Cycle de régulation des CRLs

Les CRLs peuvent être activés par neddylation (l'attachement de la protéine NEDD8 au CRL), et ils

peuvent être désactivés par deneddylation (détachement de NEDD8) ainsi que par leur séquestration par la protéine CAND1 (ce qui empêche leur assemblage en un complexe). 15 II.1 La neddylation et son rôle dans la localisation des crossovers chez

Arabidopsis

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l'analyse et à la caractérisation de la méiose chez le

mutant axr1. Ce mutant a été initialement caractérisé par sa résistance à l'auxine (Lincoln,

Britton, & Estelle, 1990). Des études ont suivi, et sa fonction dans la voie de

neddylation/rubylation a été mise en évidence (Leyser et al., 1993). AXR1 code une des sous-

unités de l'enzyme activatrice E1 du complexe de neddylation. La neddylation représente une voie importante de modification post-traductionnelle des protéines. Elle est responsable de l'activation de CRLs en permettant l'assemblage des protéines en complexes.

Les plantes mutantes

axr1 sont affectées au niveau de leur développement, comme le montre la figure 11. L'analyse du développement reproductif de ces plantes a montré que la méiose est

anormale chez axr1. Des analyses plus précises ont ensuite été réalisées afin de comprendre quel

mécanisme méiotique spécifique était affecté. J'ai pu montrer que la recombinaison est affectée

chez le mutant axr1, et que le crossover obligatoire n'est plus en place (Figure 12). D'autre part, mes études ont montré qu'axr1 est capable de produire le même nombre de crossovers que les plantes sauvage, mais que ces COs ne sont pas localisés de la même façon que chez le sauvage (ils ne présentent plus d'interférence et ils ont tendance à se regrouper). 16 Figure 11: Les défauts développementaux d"axr1

Plantes sauvages (Wt) ou mutantes (axr1) âgées de cinq (A) ou neuf (9) semaines. Les mutants axr1 sont

nains, très ramifiés et présentent des siliques courtes. La coloration d'Alexander (C-D) colore en rouge les

grains de pollen viables chez le sauvage (C) alors que chez axr1 un mélange de grains de pollen morts et

vivants (rouge) est observé. Les produits de la méiose observés en microscopie interférentielle (E,F)

forment des tétrades de microspores chez le sauvage (E) et des tétrades déséquilibrées ou des polyades chez le mutant axr1 (F). 17

Figure 12: Les mutants axr1 sont caractérisés par la production d"un déficit en bivalents en

métaphase I Coloration au DAPI des chromosomes méiotiques chez le sauvage (A-H) et chez axr1 (I-P). (A, I)

leptotène, (B, J) : pachytène, (C,K) : diplotène, (D, L) : diacinèse, (E,M) : Métaphase I, (F,N) : anaphase I,

(G,O) : anaphase II, (H,P) : Télophase II. Echelle = 10µm 18 Figure 14: Les CO de classe I sont localisés de façon aberrante chez axr1

HEI10 ou MLH1 ont été immuno-localisées sur des étalements de chromosomes méiotiques du sauvage

(A, B, E, Col-0) ou d' axr1 (C, D, F). Chez axr1, le nombre moyen de foyers HEI10 ou MLH1 par cellule est

identique au sauvage (G). 19 II .2 La séquestration des CRLs par CAND1 est essentielle au bon déroulement de la recombinaison méiotique chez Arabidopsis

Suite à nos découvertes concernant la régulation de la localisation des crossovers par la voie de

neddylation, nous avons décidé d'analyser d'autres régulateurs de l'activité des CRLs dont la

protéine CAND1 qui est responsable de la désactivation des CRLs. CAND1 se lie à des complexes CRL, provoquant leur désassemblage et l'inhibition de l'ubiquitination des cibles (Chua, Boh, Ponyeam, & Hagen, 2011; Hotton & Callis, 2008; Wu et al., 2013).

J'ai observé

que les mutants cand1 présentent des défauts majeurs de recombinaison (Figure 15). Ce défaut de recombinaison méiotique semble plus prononcé chez les mutantsquotesdbs_dbs43.pdfusesText_43

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