[PDF] Analyse du mécanisme dentrée du virus de lhépatite B

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DOCTEUR DE

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

SPÉCIALITÉ

: Microbiologie

Somar Kassab

Variabilité du virus de l'Hépatite B

Sous la direction de

Michael Kann

Mr le Docteur Jean ROSENBAUM (directeur de recherche, INSERM 1053)

Président

Mr le Docteur David DURANTEL (chargé de recherche, INSERM 1052)

Rapporteur

Mr le Docteur Patrick SOUSSAN (MCU-PH, INSERM 1135) Rapporteur Mr le Professeur Michael KANN (directeur de l'UMR-CNRS 5234) Directeur de thèse Titre : Variabilité du Virus de l'Hépatite B

Le polymorphisme génétique du virus de l'hépatite B (VHB) a déjà été étudié pour

tenter de comprendre les facteurs viraux influençant l'évolution de la maladie, mais les études

sont discordantes. Ceci peut être lié au fait que les précédents travaux n'ont été menés que

dans des populations avec une faible variété de génotype s et présentant des charges virales plasmatiques (CVP) élevées. Nous avons donc étudié la variabilité du génome complet du VHB chez 422 individus infectés chroniquement, naïfs de traitements anti-viraux et dont 38% présentaient une CVP inférieure à 10 3 UI/mL. L'optimisation de l'amplification par PCR du génome complet du VHB nous a permis de séquencer en technique Sanger plus de 90% du génome pour 320

échantillons. Le séquençage direct a mis en évidence des co-infections. Ceci a été confirmé en

séquençage clonal par pyroséquençage de 27 échantillons qui a montré des proportions de

particules défective s variables mais toujours en co-infections avec des sous-populations sauvages. Le génotypage des séquences obtenues par technique Sanger a montré une grande

représentativité des génotypes les plus fréquents (A à E) ainsi que 60 potentiels recombinants

inter-génotypiques. Cependant le séquençage clonal par pyroséquençage et clonage vectoriel

classique de ces dernie rs montre la présence de co-infections de plusieurs génotypes ou la présence de génotypes intermédiaires entre génotypes proches. Ceci est en défaveur de

recombinaison par échange de matériel génétique comme ce qui a été suggéré dans la

littérature. Cette étude sera complétée par l'analyse de corrélation entre les polymorphismes et les marqueurs de mauvaise évolution de la pathologie.

Mots clés

Virus de l'Hépatite B, variabilité interindividuelle, variabilité intraindividuelle, virus défectif, recombinant inter-génotypique.

Title : Hepatitis B Virus variability

The genetic polymorphism of hepatitis B virus (HBV) has been investigated to understand its impact on disease evolution, with discordant results. This could be due to the narrow range of genotype and plasmatic viral load in these studies. We analysed complete genome variability of circulating HBV, in 422 chronically infected patients. All were naive of anti-viral treatement and 38% had a plasmatic viral load below 10 3 UI/mL. After optimisation of full length genome PCR amplification, we obtained

Sanger sequences

for more than 90% of HBV genome in 320 samples. We detected by direct sequencing multiples co-infections that were confirmed by clonal pyrosequencing in 27 samples. Defective viruses were always observed in co-infection with wild type virus. Direct sequences showed a large representation of the most frequent genotypes (A to E), but also 60 potential inter-genotypic recombinants. Clonal pyrosequencing and vectorial sequencing showed that these potential recombinants were co-infections with different genotypes or intermediate genotypes located between close genotypes. These observations are in contradiction with the hypothesis described in the literature on recombination by genetic material exchange. This study will be completed by a correlation analysis between the polymorphisms and markers of bad prognosis during HBV-induced disease.

Keywords :

Hepatitis B virus, inter-individual variability, intra-individual variability, defective virus, inter-genotypic recombinant.

Unité de recherche

Laboratoire de Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité

Remerciements

difficiles. de moi acceptée e. mener - te Vir perfectionnisme. Aurélia, je te souhaite tout le meilleur et te remercie du fond du coeur.

CHU de Bordeaux

avoir partagé son savoir sur le VHB et son intérêt pour ce travail.

Plateau

Sommaire

Sommaire

Liste des abréviations

Introduction

Généralités

Structure de la particule virale

Organisation du génome

Cycle viral

Réponse immunitaire

Pathologies

Infection aiguë

Infection chronique

Fibrose et carcinome hépato

Prévention et traitement

Variabilité du VHB

Hepadnaviridae

Génotypes

adie

Matériels et méthodes

Prélève

Extraction des acides nucléiques

Amplification du génome complet par PCR

PCR pour les charges virales supérieures à 103 3 PCR nichées sur produit de PCR génome complet

Séquençage direct par méthode Sanger

Réactions d

Analyse des séquences

Conception des amorces de réactions de séquence

Pyroséquençage avec la technique 454

Principe

Conception des amorces

Purification des amplicons avec le protocole Agencourt® Ampure® XP de Beckman

Dosage des amplicons avec le kit Quant

sion (emulsion

Analyse des séquences

Séquençage clonal

Clonage vectoriel plasmidique, technique In

Clonage vectoriel plasmidique, pGEM®

Séquençage des plasmides

Entropie de Shannon

Résult

3UI/ml

Séquençage direct du génome vi

Amplification du génome complet du VHB

Taux de couverture par séquençage du génome viral

Populations multiples

Vérification des c

Génotypes

Séquençage clonal par pyroséquençage

Choix des échantillons

Le contrôle plasmidique

Pyroséquençage des patients

Co Co

Délétions

Codons STOP

Séquençage clonal classique

Recombinaisons

Délétions

Discussion

Polymorphisme du génome du VHB

Codons stop

Co

Génotypes indéterminés

Perspectives

Conclusion

Annexes

Annexe

Annexe

Références

Liste des abréviations

épatite B de la marmotte

Introduction

(VHB) C, ils sont les principaux agents infectieux responsables de cancer e organisent

Figuremodéré à fort

zones correspondent

Généralités

V

Structure de la particule virale

42
enveloppe entourant DN, une polymérase

Figure

bourgeonnement de la HB .VDXIOH

4ème er nd

nd ème

érieur de la par

(5) pour les génotypes B, E et partiellement C et D sur

Figure Į

transmembranaires. ème ème Į e, , asparagine 146 (losange, est N

phosphorylé sur la sérine 118 bien que cette dernière ne soit pas indispensable à infectivité

Figure

la particule virale, LHBs expose le site de domaine matrice (DM) interagit avec la capside.

Des trimères de cnt

Figure

a

Į es pics des

poly core une u brin

Organisation du génome

Les 4 cadres de lecture

ène HBe (

Il

țrs hépatiques tel

HBe préS

Figure

chapitre 2, edited by C.L. Lai and S. Locarnini, second ed

Cycle viral

médiaire du domaine N irculaire covalemment clos (ADNccc) via les étapes

Figure

(ADNccc) qui est capside immature dans laquelle soit redirigée vers le noyau pour augment- tre libérées dans le milieu extracellulaire. A partir du RE pseudoolgi pour ê cellulaire pour deux extrémités sont chevauchantes et dont les deux extrémités sont chevauchantes

Figure

e cha produisant une protéine de 15 indispensable à cette dernière. En effet, des patients sont

HBx est

atocytes humain e activant les protéines des voies de transduction telles que Src kinase i

İde

9

La ne . Ces

Figurİdans le domaine précore.

de la Polymérase dég - 10 - r . Lx le saut de brin de DR1 vers DR2

ADN double linéaire (ADNdl) (figure

Figure

la polymérase dégradé- pas lieu dans toutes les cellules infectées (0.2% des hépatocytes pour WHV ans il a été décrit une peut être perturbée. (71) (73) ligases

Ȗ(74)

4 R cytokines sécrétées non seulement par les , les lipopolysaccharides de gènes codant pour des cytokines (Interleukines, Interféro

Figure

des activation i

TableauISG

ISG Mécanismes anti-VHB

MyD88 (83) Dégradation des ARNm dans le cytoplasme

MxA (84) (85) Inhibition de

core

CNP (86) Inhibition de la traduction des ARNm

Indoleamine 2,3-deoxygenase (87) Inhibition de la traduction des ARNm Zinc Antiviral Protein (88) Dégradation des ARNm dans le cytoplasme APOBEC3 A et B(figure 12) (89) Désamination des ADNccc induisant leur dégradation Inhibition de la transcription des gènes viraux Figure les désaminases de la famille p-Į empêchant la transl

İprotéines adaptatri

e ité adaptative immunologique. t la réponse immunitaire contre

les hépatocytes infectés sécrètent une protéine chaperone sHSP60 qui activerait les LTreg par

le VHB,infection é P

principalement liée à la réponse immunitaire contre les hépatocytes infectés et à son pouvoir

infection

Infection aiguë

sexuelle et par un istent 6 , débute la cytolyse hépatique aiguë se traduisant hépatocellulaire traitement est la greffe de hépatique en ni

Parallèlement, on observe une séroco

les AcHBs. persiste de façon latente dans le no acquise ou

Infection chronique

HBs alors devenue persistante chronicisation de- envers les épitopes viraux les hépatocytes infectés (ASAT/ALAT normales) malgré une réplication virale intense av 6 , il existe un équilibre permanent et dynamique , peut survenir une phase c une réaction lymphocytaire cytolytique faisant augmenter les séroconversion une immunotolérance.incidence annuelle cellulaire

Tableau

Immunotolérance Séroconversion HBe Inactive Réactivation Mutant préC

AgHBs + + + + +

AcHBs - - - - -

AcHBc + + + + +

ADN +++ Ļ - Ĺ ++

AgHBe ++ Ļ - Ĺ -

AcHBe - Ĺ ++ Ļ +

ASAT/ ALAT

ème

ar les L n virale

Fibrose et c

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